Le plasmide a t'il l'insert?

[invitee8702407]

Bonjour à tous,

Je possède un plasmide pBR330 avec
- une résistance à l'Amp^R
- un site de coupure EcoRI (sur le site de résistance Amp^R)
- une Origine de réplication
- un site de résistance à la streptomycine

Dans ce plasmide, on veut cloner au site EcoRI un fragment d'ADN génomique de Salmonella portant le gène neoA (homologue à Salmonella) et qui confère une résistance à la néomycine.

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Pour savoir si les plasmides (dans la bactérie) ont l'insert, l'idée serait de sélectionner sur néomycine. Mais apparement la bactérie aurait déjà un gène de résistance à la néomycine, donc on ne saurait pas si c'est la bactérie ou le plasmide (avec insert) qui donne la résistance.

Alors on utilise la résistance à la streptomyine.
Mais là j'ai un problème: la résistance à la streptomycine se trouve sur le vecteur et non sur l'insert. Donc dans ce cas nous sélectionnons simplement les bactéries qui ont un plasmide (avec ou sans insert)?

Comment déterminer alors quels sont les plasmides qui ont l'insert et ceux qui ne l'ont pas?
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[inviteffc67642]

Salut !

Tu peux faire deux choses :

- sélectionner positivement sur streptomycine et négativement sur ampicilline (si j'ai bien compris, ton vecteur confère une résistance à la strept et si ton insert est là, les bactéries perdent leur résistance à l'ampicilline).
Donc vérifier que tes bactéries sans plasmide sont bien sensibles aux deux antibios, et d'abord faire pousser les bactéries transformées sur strept, puis repiquer les colonies en les identifiant sur ampicilline, puis tester par miniprep celles qui ne poussent pas sur ampicilline.

- changer de bactéries et prendre des souches de bactéries sensibles à la néomycine.

Joyeux Noel !!

[invitee8702407]

Oui! Pour la première idée c'est super, je n'avais pas pensé à tester en plusieurs étapes à l'aide de deux résistances différentes!

Pour la dernière j'y avais pensé, mais malheuresement on nous impose ces bactéries (pourquoi chercher simple quand on peut faire compliqué hein???)

Bref, merci pour la clarté et la rapidité de cette réponse Bonnes fêtes et Joyeux Noel à toi aussi!

[piwi]

Salut,

L'idée est de sélectioner à la streptomycine les clones ayant intégrés le plasmide.
Ensuite dans un second temps on fait une réplique de la boite sur une boite ampi.
Les clones vides sont résistants alors que les clones+ plasmides ont perdu cette résistance (on a cassé le gène en insérant notre fragment). Par comparaison on retrouve nos clones intéressants.

Voili voilou.

piwi

note: j'avais pas tout lu. La réponse était deja là ^_^

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite17a570c1]

Oui, juste compléter : par la néomycine + strepto, tu sélectionneras les bactéries ayant un plasmide recombiné (on nous demande toujours de faire cette vérification pour être sûr que le plasmide porte bien le gène d'intérêt). Plus intéresant serait de faire une construction avec LacZ à la place du gène de la béta-Lactamase : cela te permettra de visualiser directement (si colonies bleues et StreptR, pas de plasmide recombiné, si colonies blanches et StreptR, plasmide recombiné dedans).

Bonne fêtes!

Cordialement,

[invitee8702407]

merci piwi et MaliciaR pour ces précisions!

Bonne fêtes à vous aussi!

[gorben]

Oui, juste compléter : par la néomycine + strepto, tu sélectionneras les bactéries ayant un plasmide recombiné (on nous demande toujours de faire cette vérification pour être sûr que le plasmide porte bien le gène d'intérêt)

Salut,

Je ne suis pas d'accord, une selection Neo/strepto ne peut certainement pas selectionner les plasmides recombinants vu que la souche de depart est neoR.
Tu vas selectionner les transformants uniquement.

Ensuite, si ton plasmide est bien coupe, et qu'il est dephosphoryle ben tous les transformants StreptoR auront un insert (plasmide circulaire) vu qu'un plasmide lineaire (sans insert) ne se replique pas dans la bacterie.

A+

[invite17a570c1]

Bonjour à tous,

Je possède un plasmide pBR330 avec
- une résistance à l'Amp^R
- un site de coupure EcoRI (sur le site de résistance Amp^R)
- une Origine de réplication
- un site de résistance à la streptomycine

Dans ce plasmide, on veut cloner au site EcoRI un fragment d'ADN génomique de Salmonella portant le gène neoA (homologue à Salmonella) et qui confère une résistance à la néomycine.

Salut,

Je ne suis pas d'accord, une selection Neo/strepto ne peut certainement pas selectionner les plasmides recombinants vu que la souche de depart est neoR.
Tu vas selectionner les transformants uniquement.

Ensuite, si ton plasmide est bien coupe, et qu'il est dephosphoryle ben tous les transformants StreptoR auront un insert (plasmide circulaire) vu qu'un plasmide lineaire (sans insert) ne se replique pas dans la bacterie.

A+

Salut,
Je ne suis pas d'accord avec toi, Gorben.

Le plasmide de départ est StreptoR et AmpR. Donc, si j'ai des colonies sur LB+strepto+amp, c'est que les bactéries ont intégré le plasmide natif.
C'est l'insert qui porte le gène de résistance à la néomycine. Donc, si j'ai des colonies sur LB+strepto+néo, c'est que mon plasmide est recombiné et est dans les bactéries.

Par ailleurs, je n'ai pas compris pourquoi tu parles de plasmide linéaire...? Tout protocole qui se respecte implique un test à la phosphatase...

Cordialement,

[gorben]

Salut,

Pour savoir si les plasmides (dans la bactérie) ont l'insert, l'idée serait de sélectionner sur néomycine. Mais apparement la bactérie aurait déjà un gène de résistance à la néomycine, donc on ne saurait pas si c'est la bactérie ou le plasmide (avec insert) qui donne la résistance.

La souche bacterienne est deja resistante a la Neo... donc selectionner sur Neo ne sert absolument a rien.

De plus, tu devrais jetter "tous les protocoles qui se respectent" et qui pronnent un traitement systematique a la phosphatase. Bien souvent la dephosphorylation du vecteur engendre une degradation des extremites et des resultats par la suite vraiment tres etranges. De plus ca t'oblige a repurifier le plasmide apres (perte de temps, d'argent et de quantite) ou alors a faire ta ligation sur un plasmide contenant de la phosphatase + du tampon phosphatase --> perte d'efficacite de la ligation. Je ne dis pas que ca ne marche pas, je l'ai souvent fait, mais les rendements sont moindres et si tu dois faire un clonage difficile, ben ca compte.
La dephosphorylation n'est vraiment necessaire que dans ce cas precis (ou dans le cas de tres petits inserts, pour eviter d'en inserer plusieurs, dans ce cas c'est l'insert qui est dephosphoryle). Generalement une double digestion correcte ou une selection positive est preferable.

A+

[invitec9f0f895]

Salut,



La souche bacterienne est deja resistante a la Neo... donc selectionner sur Neo ne sert absolument a rien.

En effet, sauf a etre certain que tu travailles avec la bonne souche de coli

De plus, tu devrais jetter "tous les protocoles qui se respectent" et qui pronnent un traitement systematique a la phosphatase.
La dephosphorylation n'est vraiment necessaire que dans ce cas precis (ou dans le cas de tres petits inserts, pour eviter d'en inserer plusieurs, dans ce cas c'est l'insert qui est dephosphoryle). Generalement une double digestion correcte ou une selection positive est preferable.

A+

d'accord pour ca aussi. C'est vrai que je ne traite quasiment jamais mes plasmides a la phosphatase.
Sinon pour identifier les plasmides ayant un inser, pourquoi ne pas faire un crible de PCR sur colonies avec un oligo specifique de l'insert et un autre du plasmide? ca marche tres bien et on est certain de la presence de l'insert (car la disparition d'une resistance par inactivation d'un gene peut aussi etre du a une mauvaise religation du plasmide sur lui meme.)

YOyo

[gorben]

Sinon pour identifier les plasmides ayant un inser, pourquoi ne pas faire un crible de PCR sur colonies avec un oligo specifique de l'insert et un autre du plasmide?

Un peu dans le meme esprit, il y a aussi le "colonie blot". Le principe est simple, tu repliques tes colonies sur une membrane de nylon, et tu procedes comme un southern blot avec une sonde specifique de ton gene (a condition evidemment que ta souche receptrice ne possede pas ce gene dans son chromosome !!!)
A+

[invite689529bc]

Salut,

Pourquoi ne pas faire une ou plusieurs mini prép d'ADN (en priquant une ou plusieurs colonies) et simplement faire une digestion suivie d'une migration sur gel d'agarose et voir si on insert est présent. Si oui repartir des bactéries qui ont intégré le bon plasmide avec insert et faire une maxi.