Alcool isoamylique

[invite6397bb2d]

salut
est ce que le remplacement de l'isopropanol par l'alcool isoamylique dans une extraction plasmidique chez Lc lactis?
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[Yoyo]

c'est quoi la question exactement?

Yoyo

[invite6397bb2d]

salut
est ce que le remplacement de l'isopropanol par l'alcool isoamylique dans une extraction plasmidique chez Lc lactis donne le même résultat attendu ?

désolé ma question etait incomplète

[piwi]

Si je suis bien, normalement vous devriez utiliser l'alcool isoamylique en fin d'extraction pour purifier le plasmide. Il doit être associé au chloroforme (SEVAG) non?
En fait, l'alcool isoamylique est un solvant que l'on ajoute pour diminuer la tension de surface et faciliter la séparation des phases.

Là où je ne vous suis plus c'est que l'isopropanol n'aurait pas la même fonction, il remplacerait plutôt l'éthanol absolu qui vient dans l'étape suivante pour précipiter le plasmide.

J'ai l'impression qu'il y a comme un mic-mac... Pourriez vous préciser votre protocole?

Cordialement,
piwi

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite6397bb2d]

Si je suis bien, normalement vous devriez utiliser l'alcool isoamylique en fin d'extraction pour purifier le plasmide. Il doit être associé au chloroforme (SEVAG) non?
En fait, l'alcool isoamylique est un solvant que l'on ajoute pour diminuer la tension de surface et faciliter la séparation des phases.

Là où je ne vous suis plus c'est que l'isopropanol n'aurait pas la même fonction, il remplacerait plutôt l'éthanol absolu qui vient dans l'étape suivante pour précipiter le plasmide.

J'ai l'impression qu'il y a comme un mic-mac... Pourriez vous préciser votre protocole?

Cordialement,
piwi

bonsoir
pour plus de précision, j'utilise le protocole de O'Sullivan et Klaenhammer ,1993

Rapid Mini-prep isolation of high-Quality plasmid Dna from Lactococcus and Lactobacillus spp.
applied and environmental microbiology,Aug.1993,p2730-2733

MERCI

[piwi]

Mais par rapport à ce que j'écrivais il y a quelques temps? Est ce que les choses sont bien comme je les vois ou est ce que c'est radicalement différent? Si tel était le cas j'irais bien volontiers jeter un œil sur la publication.

Cordialement,
piwi

[invite6397bb2d]

je pense qu'il faut jeter un coup d'oeil pour me comprendre! car cette étape où j'ai remplacer l'isopropanol (indisponible au moment où j'ai réalisé cette extraction) par l'alcool isoamylique est bien avant la phase phénol-chloroforme!

merci piwi

[piwi]

Ok Il font juste une première précipitation du plasmide avant le phénol chloroforme.
Donc non, ça ne change rien, vous ne pouvez évidemment pas remplacer l'isopropanol par de l'alcool isoamylique.
Ce que vous pourriez éventuellement faire c'est remplacer par de l'ethanol 70. Je pense que ça doit pouvoir aller (je ne l'ai jamais fais en pratique).

Cordialement,
piwi

[invite6397bb2d]

merci PIWI

[IngDr]

Ce que vous pourriez éventuellement faire c'est remplacer par de l'ethanol 70. Je pense que ça doit pouvoir aller (je ne l'ai jamais fais en pratique).

Petite précision.

L'isoporopanol peut effectivemet être remplacé par l'éthanol, mais à 100%et non 70%. L'avantage de l'isopropanol par rapport à l'Ethanol est de pouvoir deshydrater l'ADN avec un volume moindre d'alcool. C'est pour cela que lors d'une précipitation à l'éthanol on rajoute 2 volumes d'Ethanol 100% pour 1 volume de solution contenant l'ADN (ce qui donne 70% env. d'Ethanol en concentration finale), et pour l'isopropanol, en général 1 volume suffit. Cela peut être pratique si on a plus de 500ul de phase acqueuse et que l'on ne dispose que d'eppendorf de 1.5ml (0.5 + 2*0.5 = 1.5 ml total).
De surcroit, l'isopropanol précipite moins les sels que l'Ethanol.

Concernant l'isoamyl alcool, c'est un dérivé du butanol, donc je dirais qu'à priori en temps qu'alcool il doit être capable de capter les molécules d'eau, et donc de déshydrater l'ADN. Mais si vous n'avez pas eu de culot après la centrifugation, c'est que ce n'est pas le cas...

[piwi]

Quand je dis EtOH 70 c'est en concentration finale évidemment. Désolé, je l'ai déjà écris tellement de fois sur le forum que je ne le précise pas toujours

[invite6397bb2d]

Mais si vous n'avez pas eu de culot après la centrifugation, c'est que ce n'est pas le cas...

j'ai pas eu de culot après la centrifugation! est ce que vous pensez que c'est dû a l'alcool isoamylique?

[IngDr]

Aîe, si pas de culot, c'est difficile à dire, car il y a 2 hypothèses :
soit l'isopropanol ne peut être remplacé par l'isoamylalcooc
soit la quantité de plasmide est faible, et le culot non visible. Cela arrive pour des petites quantités d'ADN (notamment, je ne sais pas si ton plasmide est un "low copy number" ou un "high copy number", ce qui peut influer sur la quantité de plasmide obtenue à la fin). Dans ce cas le culot est "étalé" sur le tube, et pas vraiment visible. Un moyen d'aider, et d'ajouter du glycogen au moment de la précipitation, qui sert de "carrier" pour l'ADN et aide à visualiser le culot.

Est ce que tu as dosé tes prep de plasmide, fait une PCR ou un gel pour voir si tu avais quand même quelque chose ?
L'idéal serait de recommencer la manip avec l'isopropanol pour repartir sur de bonnes bases.

[invite6397bb2d]

salut
en fait avec un autre essai avec l'isopropanol , je vois nettement mon culot au fond, mais le résultat de l'éléctrophorèse je trouve que l'ADN chromosomique dans les puits et pas de plasmides pour mes 2 souches différentes de Lactococcus lactis !! comment se fait-t-il??

[Switch31]

petite question au passage ... j'utilise un kit Qiagen pour purifier de l'adn migré en agarose ; une étape nécessite un tampon TE (surtout composé d'etOH 70%) ... quel est le rôle de celui-ci en fin de purif??? autrement dit, permet d'il d'éliminer les traces d'isopropanol et de sels ???

merci de votre réponse

[waymouch]

Bonsoir a tous,
s'il vous plait qui sait la différence entre l'utilisation du phenol-chloro-isoamylique et le chloroforme isoamylique tout court pendant l'extraction?
merci d'avance.