Problème transfo...

[invite17a570c1]

Chers 'zamis et voisins

J'ai un souci... En fait, j'ai fait une transformation après une ligation (pET28b+ et l'insert qui m'intéresse) et ensuite les bactos électrocompétentes KanR ont subi une miniprep sur laquelle j'ai fait des digestions avec BamHI et NcoI.
Et même si je refais la digestion pour la 2e fois aujourd'hui, j'ai une fâcheuse permanence dans les résultats! Je prends toujours mini 10 clones de chaque transfor (ici, 2 transfos, donc 20 clones ont donné leurs plasmides pour la sciences ) et je me retrouve avec exactement les mêmes bandes (même PM et même intensité) à la fin... Mais le truc pas parfait du tout dans l'histoire c'est que ces bandes ne correspondent en rien avec celles que j'attendais J'ai testé :
* le problème de coupure : elle se fait bien chez le plasmide natif, avec le même mix que chez les échantillons;
* le problème d'enzyme : les enzymes sont actives (testé chez un autre plasmide différent);
* mon contrôle négatif est évidemment ok (si je mets le plasmide natif circulaire sans enzymes, il migre comme attendu);
* mon contrôle positif est ok aussi (le plasmide prédigéré non ligué en absence des enzymes en question migre comme prévu).

Je me dis que la seule chose qui déconnerait ici ce serait les bactos : il me paraît de plus en plus évident que j'ai eu une contamination à ce niveau-là, donc les bandes que j'obtiens à la fin de la digestion aujourd'hui correpsondent à un plasmide contaminant. Mais ce que je ne comprends pas c'est qu'hier soir j'ai testé mes autres transformants avec les mêmes cellules compétentes et tout roulait

Du coup, je ne sais plus quoi penser... J'ai envisagé :
* je me suis plantée de plasmide : mais aucun des plasmides autres que je possède n'est compatible avec les résultats immuables des 2 digestions d'aujourd'hui...
* toutes les cellules électrocompétentes ont été contaminées par une autre sauche possédant un plasmide portant un gène de résistance à la kana : il faut donc que j'étale sur boîte LB + kana des bactos non transformées et voir ce que ça donne, non?
* la technicienne préparant les boîtes a merdé, le plus probablement au niveau des antibios qu'elle a mis sur les boîtes : il faut donc que je teste les boîtes avec une autre souche KanS?
* ma ligation a été contaminé : il faut donc que je la refasse en parallèle des autres contrôles, non?

Tout ceci pour demander votre avis sur la question... Qui m'a bouffé ma journée et qui risque d'en bouffer plusieurs autres vu que j'envisage de recommencer la totale (bactos compétentes + ligation + transfo...).

Merci

Cordialement,
-----

[piwi]

J'ai un peu de mal à suivre ce que tu fais, comme si tu disais ma manip marche pas comment je fais?

Ca linéarise dans le plasmide natif et ça sort un fragment dans le plasmide recombiné?
Tu l'as rentré comment ton insert? Est il simplement possible qu'il ne soit pas dans l'orientation que tu imagines?

Cordialement,
piwi

[invite17a570c1]

Je ne suis pas trop claire, désolée...

En fait, le plasmide natif est linéarisé, les enzymes sont fonctionnelles. Lorsque je digère les plasmides issus des transformants, j'ai des bandes qui ne ressemblent strictement à rien de ce que j'attends... J'attends une bande entre 4 et 5 kb qui correspond à mon plasmide linéarisé et une bande à environ 1,3 kb qui correspond à l'insert. J'obtiens une bande à 5 - 6 kb et une autre à 2,5 kb... Et ce, pour tous les 20 clones... (Au moins, j'ai une reproductibilité de 100 % )

J'espère que c'est un peu plus compréhensible

Cordialement,

[invite8c0cc995]

A tout hasard, tes enzymes générent elles des extrémités compatibles ? Du coup lors de la ligation tu as pu créer des doublets d'inserts qui ne peuvent plus être digéré (2.5 ~2x1.3 kb). Que tu en aies dans tous les clones serait vraiment pas de chance...

Edit : je viens de voir que tu as mis les enzymes. BamHi et NCOi n'ont pas l'air compatible. Mea Culpa

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite17a570c1]

Non, l'une des extrémités est coupée par BamHI, l'autre par NcoI. Ceci n'explique d'ailleurs toujours pas l'histoire du plasmide fantôme... Pour moi, c'est une contamination : mes bactéries ont choppé une MST

Cordialement,

[gorben]

Salut,

Tu as dephosphoryle ton insert et ton plasmide avant de liguer?

Verifie tes clones par PCR, ca te dira dessuite si tu as le bon plasmide ou pas. Primer F ou R dans l'insert et R ou F dans le plasmide (verifie l'insertion en orientation correcte), et primer F et R dans le plasmide (verifie si il y a une insertion, et de quelle taille).

A+

[invite17a570c1]

Je n'ai pas déphosphorylé, non... Je pensais le faire puis d'autres au labo m'ont dit que ce n'était pas la peine.
Je pense faire la PCR demain, oui
Mais c'est quand même bizarre.

[invitec9f0f895]

salut

ton insert tu l'as obtenu comment?
Si tu fais une simple digestion BamHI et une simple digestion NcoI tu obtiens quoi?

Yoyo

[invite17a570c1]

Salut,
Je n'ai pas fait de simple digestion... Disons que le résultat absolument identique partout après 2 essais est assez concluant pour penser que je n'ai pas tout à fait ce que pensais dans mes tubes

Et puis, ma chef ne veut pas que je perde du temps dans de tels contrôles...

Cordialement,

[invitec9f0f895]

Ca elle a tout a fait raison, mais a titre d'info la simple digestion t'aurai indiqué si tu n'avais pas cloner deux inserts (meme si les sites ne sont pas compatibles).

Tu l'as obtenu par PCR ton insert?

YOyo

[gorben]

Ta chef a raison, perd pas ton temps avec ca...
Deja verifier une ligation par digestion c'est pas ma facon preferee. Les digestions ont souvent (et encore je suis gentil de pas dire tout le temps) des problemes... Une PCR est plus rapide, moins chere, et te donne de meilleur resultats.
Si par la suite la PCR a un probleme, tu peux tjs faire une digestion, mais la PCR est la methode preferee (sauf si evidemment tu as clone 100 Kb dans un BAC )

A+

[piwi]

Je ne suis pas tout à fait d'accord moi.
Personnellement quand je fais une double digestion je fais toujours les simples en même temps. Parce qu'après, quand ça ne se passe pas comme on le voulait on se dit toujours que l'on aurait du les faire ces contrôles qui ne servent à rien.

[invite17a570c1]

Bonjour,

Merci pour tous les conseils
En fait, je n'ai jamais pensé à faire de simples digestions peut-être parce que jusque là je n'ai fait que des clonages "simples" = sans soucis et particularités... Ceci dit, vu la tête de ces digestions, je doute fort qu'une PCR soit utile : il n'y a pas mon plasmide dedans, déjà quand je pense aux intensités des bandes (celle à 2,5 kb est systématiquement beaucoup plus intense que celle à 5-6 kb, donc j'ai une quantité beaucoup plus grande de cet ADN, alors que je m'attendais quand même à des bandes d'intensités très similaires puisque je suis en équimolaire)...
Ceci dit, je compte vérifier les cellules, les boîtes et refaire les ligations et les transfos, cette fois avec tous les contrôles

Bonne journée

Cordialement,

[invitec9f0f895]

tu n'as toujours pas répondu a ma question....
moi personnellement je te conseillerai d'utiliser différents ratios insert/plasmide.

Franchement je crois pas a la contamination par une autre souche de coli portant un plasmide KanR. Je pense que la bande a 5-6kb est ton pet28b le probleme viens de ton insert, pas de ton plasmide.

YOyo

[piwi]

Salut,
J'ai pas eu le temps de vraiment répondre hier au soir.

J'attends une bande entre 4 et 5 kb qui correspond à mon plasmide linéarisé et une bande à environ 1,3 kb qui correspond à l'insert. J'obtiens une bande à 5 - 6 kb et une autre à 2,5 kb

Tu attends un plasmide total de ~5,8kb et tu as 8kb. Il y a 2,3 kb de trop.
Alors comme l'on dit les autres soit tu cherches à comprendre ce qui c'est passé soit tu oublies et tu recommences. Comme tu n'as pas fais les contrôles le mieux est effectivement de tout recommencer sans te faire suer, c'est le plus simple.
L'intérêt de faire les contrôles c'est évidemment de pouvoir dégrossir la situation pour voir si l'on peut espérer avoir un clone et savoir si ça vaut la peine de faire un gros screen ou si il vaut mieux tout recommencer (quand on fait un clonage difficile on a pas toujours envie de recommencer.)

Sinon, pour ça:

je m'attendais quand même à des bandes d'intensités très similaires puisque je suis en équimolaire

Tu fais une erreur conceptuelle.
Tu est bien équimolaire entre le plasmide et ton insert. Cependant l'intensité de la bande est fonction du nombre de nucléotide (BET, agent intercalent, plus y a de bases plus y a de BET) qui la compose, donc non pas de la molarité mais de la quantité de nucléotide dans la bande.
Donc ta grande bande est composé de trois fois plus de nucléotides que la petite. Du coup, normalement, la petite bande est moins intense que la grande. C'est ce qui fait qu'en général, plus la bande attendue est petite plus on a du mal à la voir.
Là, de manière systématique, c'est le contraire. C'est curieux.

Pour les boite je ne vérifierais même pas. Tu prends du LB agar, tu mets ton antibio et tu te coules tes propres boites. Ca prends 5 minutes et t'es tranquille.
Cordialement,
piwi

[invite17a570c1]

tu n'as toujours pas répondu a ma question....

Excuse-moi, je suis un peu à l'Ouest depuis hier
J'ai obtenu mon insert par PCR, oui. Je l'ai vérifié après sur gel, ça collait avec ce que j'attendais.

moi personnellement je te conseillerai d'utiliser différents ratios insert/plasmide.

Ah oui? Pourquoi? (Je ne suis pas une pro du clonage, loin s'en faut )

Franchement je crois pas a la contamination par une autre souche de coli portant un plasmide KanR. Je pense que la bande a 5-6kb est ton pet28b le probleme viens de ton insert, pas de ton plasmide.

YOyo

Tu attends un plasmide total de ~5,8kb et tu as 8kb. Il y a 2,3 kb de trop.
Alors comme l'on dit les autres soit tu cherches à comprendre ce qui c'est passé soit tu oublies et tu recommences. Comme tu n'as pas fais les contrôles le mieux est effectivement de tout recommencer sans te faire suer, c'est le plus simple.
L'intérêt de faire les contrôles c'est évidemment de pouvoir dégrossir la situation pour voir si l'on peut espérer avoir un clone et savoir si ça vaut la peine de faire un gros screen ou si il vaut mieux tout recommencer (quand on fait un clonage difficile on a pas toujours envie de recommencer.)

Je ne vais pas m'embêter avec d'autres contrôles que ceux des inserts, en fait. Je veux dire, la contamination des souches me paraît un peu douteuse... Et effectivement, plus j'y pense, plus il me semble logique que ce soit un souci d'inserts. Donc, je vais transformer avec eux seulement, on verra ce que j'obtiendrai
Mon ADN template vient de B. subtilis; j'ai eu un doute pendant 10 sec pour savoir si des plasmides de B. subtilis peuvent survivre chez E. coli, mais je me dis que là ça devient de la SF

Tu fais une erreur conceptuelle.
(...)

Oui, tu as tout à fait raison, j'ai dit une grosse ânerie

Pour les boite je ne vérifierais même pas. Tu prends du LB agar, tu mets ton antibio et tu te coules tes propres boites. Ca prends 5 minutes et t'es tranquille.
Cordialement,
piwi

Je pense que c'est ce que je vais faire

Cordialement,

[gorben]

Mon ADN template vient de B. subtilis; j'ai eu un doute pendant 10 sec pour savoir si des plasmides de B. subtilis peuvent survivre chez E. coli, mais je me dis que là ça devient de la SF

Salut,

Ca n'a rien a voir avec de la SF, il y a meme fort a parier que les origines de replication des plasmides de bacillus soient completement differentes des origines des plasmides de coli ! Ca demande a etre verifie, mais si ton plasmide n'a pas une origine coli, ca risque de poser probleme... (bien que honnetement je dourte fort que ca influe sur la taille de l'insert).

Par contre bacillus est un gram+, donc un %GC plus faible que E. coli. Quand je bossais sur une bacterie a faible %GC, j'avais souvent des problemes d'expression (les sequences a haut taux de AT sont souvent reconnues a tort par coli comme etant des promoteurs), voire de mutations, ou de duplications (les ADN/ARN pol de coli n'aiment pas les succession A/T). Par contre je n'ai jamais eu une duplication de 1.5 Kb
Mais il se peut par exemple que tu te retrouves avec un "hot spot" de slippage qui cree ou detruit un site BamHI et/ou NcoI. Ce serait pas de chance, mais c'est tout fait possible... La PCR devrait repondre a cette question !

A+

[invite17a570c1]

Salut,

Ca n'a rien a voir avec de la SF, il y a meme fort a parier que les origines de replication des plasmides de bacillus soient completement differentes des origines des plasmides de coli ! Ca demande a etre verifie, mais si ton plasmide n'a pas une origine coli, ca risque de poser probleme... (bien que honnetement je dourte fort que ca influe sur la taille de l'insert).

Par contre bacillus est un gram+, donc un %GC plus faible que E. coli. Quand je bossais sur une bacterie a faible %GC, j'avais souvent des problemes d'expression (les sequences a haut taux de AT sont souvent reconnues a tort par coli comme etant des promoteurs), voire de mutations, ou de duplications (les ADN/ARN pol de coli n'aiment pas les succession A/T). Par contre je n'ai jamais eu une duplication de 1.5 Kb

Aha, donc finalement je n'avais pas totalement tort de me poser cette question... Vive la SF

Mais il se peut par exemple que tu te retrouves avec un "hot spot" de slippage qui cree ou detruit un site BamHI et/ou NcoI. Ce serait pas de chance, mais c'est tout fait possible... La PCR devrait repondre a cette question !

A+

Une autre possibilité, en effet. J'ai fait une digestion avec une autre enzyme ayany un site entre BamHI et NcoI, histoire de voir si la délétion ne s'est pas produite à ce niveau, en attendant d'autres résultats plus convaincants

Merci, Gorben

Cordialement,

[invite17a570c1]

Bonjour,

Juste pour l'anecdote : je ne sais pas ce qui se passe précisément avec ce plasmide, mais il y a en fait à chaque fois un bout d'environ 1,3 -1,4kb qui manque... Et dans ce bout, il y a évidemment mes sites BamHI et NcoI
Je suis paratiquement sûre même si ça a l'air bizarre. Les 10 jours de contrôles de chaque étape ne m'ont laissé que cette possibilité...
Si quelqu'un a une autre idée, je suis preneuse
Pour le moment : je change de plasmide

Cordialement,