Test d'activité des kinases

[invite54c908a4]

bonjour à tous, est ce que quelqu'un pourrait m'expliquer clairement ce qu'est le "immunocomplex kinase assay" et quel est l'interet de cette technique, merci beaucoup!
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[invitea0443c8c]

Bonjour.
Peux tu préciser le contexte STP?

Merci

V.

[invite54c908a4]

il s'agit d'étudier l'activité des kinases IKK et ERK1/2 en utilisant leur susbstrat mais j'en sais pas plus!

[invitea0443c8c]

Bonjour!
Le but est d'observer la phosphorylation des substrat de ces 2 kinases. Je ne vois pas quoi dire d'autre...

V.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite54c908a4]

ça j'ai bien compris mais ma question était + d'ordre technique, comment met on en oeuvre cette méthode et qurtout qu'apporte t-elle de + par l'étude des phosphorylation de ces mêmes substrats par western blot?

[invite71f23525]

Pour un Western sur des phosphorylations, il faut posséder des anticorps spécifique de la phosphorylation que tu recherches dans ta protéine. Hors si c'est un site de phosphorylation encore inconnu, aucun anticorps ne sera disponible. En plus il peut y avoir des croisements de reconnaissance. Car si le site est connu mais que sa séquence est la même qu'un ou plusieurs autres sites sur la protéine, l'anticorps ne pourra pas être spécifique d'un seul de ces sites, à moins peut-être si les épitopes sont conformationnels...

Donc un essai kinase permet une évaluation plus directe d'une phosphorylation, à condition d'avoir une version Wt et une version mutante inphosphorylable sur le site que tu recherches et/ou que tu veux étudier. C'est assez simple comme expérience. Dans un même tube tu met ta protéine, de l'ATP froid et de l'ATP radiomarqué au 32P, et la kinase phosphorylant ton site d'intérêt. Tu incube à 30°C pendant le temps qu'il faut puis tu dépose sur gel et tu fais migrer. Ensuite tu fixes dans l'acide acétique pour limiter la diffusion des bandes et tu révéles en appliquant un écran radiosensible que tu révèles à un phosphorimager.

Greg

[invitec99d9c39]

Bonjour a tous,

L'autre info que je pourrais apporter serait aussi que les test d'activite kinase servent a voir l'activite des kinase en ce sens qu'une simple visualisation d'une phosphorylation ne rend pas compte de l'activite de la kinase qui en est responsable. En faisant des essais kinase tu peux dire avec precision que dans telle ou telle condition la kinase etudiee est non seulement active ou ihnibee mais aussi tu peux avoir une activite plus ou moins forte de celle-ci. Les differents controles peuvent etre l'utilisation d'inhibiteurs s'il en existe mais aussi l'asbence de kinase par exemple....
en esperant avoir ete utile...