Quelle stratégie adopter?

[invite2769cbb0]

bonjour

je voudrais montrer l'interaction de deux proteines (ici PG1alpha et SIRT1) dans les cellules hépatiques.
Pour se faire j'ai construis deux vecteurs, le premier contient un promoteur fort puis la PG1 et la GFP et le deuxième contient un promoteur fort puis la SIRT1 puis la luciférase je réalise un BRET en excitant la luciférase avec coelenterazine j'ai donc fluorescence de la GFP j'ai donc bien montré l'interaction or le professeur me demande de faire un test de localisation puis un test de fonction de la proteine endogène pour cela est ce que je dois prendre des cellules hépatiques non transfectées comme temoin? pour la localisation il me semble qu'il serait judicieux de faire une immunohistochimie mais est ce que je detecte les 2 proteines dans la meme cellule et ceci avec 2 anticorps différents couplés avec une fluorescence différente?et pour la fonction je ne sais pas dutout d'autant plus qu'il faut savoir si la proteine chimerique modifie les fonctions endogènes de la proteine pour ca je netrouve pas de strategies
merci beaucoup pour votre aide
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[Zellus]

Salut,

est ce que je dois prendre des cellules hépatiques non transfectées comme temoin? pour la localisation il me semble qu'il serait judicieux de faire une immunohistochimie mais est ce que je detecte les 2 proteines dans la meme cellule et ceci avec 2 anticorps différents couplés avec une fluorescence différente?

Je pense que l'immunohistochimie est une bonne idée oui. Pour faire une colocalisation il FAUT le faire dans la même cellule oui et avec des fluorescences différentes.
Par contre je ne sais pas trop s'il faut faire avec des cellules transfectées ou pas. Je pense que ça dépend des anticorps dont tu disposes. Si tu as des Ac anti-PG1alpha et anti-SIRT1, des cellules non transfectées suffisent peut-être. Sinon tu dois pouvoir trouver facilement dans le commerce des AC-anti GFP (pour la GFP peut-être même que ça fluorescence suffit et qu'il n'y a pas besoin d'AC) et anti-luciférase à utiliser sur des cellules transfectées.
Le choix de la transfection ou pas dépend sans doute aussi de la sensibilité de l'immunohistochimie (je n'ai jamais utilisé cette technique donc je ne sais rien là dessus ), et donc de la quantité de protéines qu'il y a naturellement dans tes cellules.

pour la fonction je ne sais pas dutout d'autant plus qu'il faut savoir si la proteine chimerique modifie les fonctions endogènes de la proteine pour ca je netrouve pas de strategies

D'ailleurs au passage la protéine chimérique modifie peut-être aussi l'interaction, d'où l'avantage de faire ta colocalisation sur des cellules non transfectées si possible.
Quelle sont les fonctions de tes 2 protéines ?

PS : désolé pour le pavé

[invite2769cbb0]

merci beaucoup pour ta réponse Zellus

donc en fait tu penses que je devrais faire deux immunohistochimie, une sur les cellules transfectées avec des anticorps anti GFP et luciférase puis une 2ème sur des cellules non transfectées avec des antcorps anti SIRT1 et PG1 mais est ce que c'est pas préferable de cibler la même chose sur les deux immunohistochimie?
et comparer la localisation et l'intensité de fluorescence donc cela serait suffisant pour voir si la proteine chimérique modifie les fonctions endogènes selon toi?
MERCI

[Zellus]

Salut,

donc en fait tu penses que je devrais faire deux immunohistochimie, une sur les cellules transfectées avec des anticorps anti GFP et luciférase puis une 2ème sur des cellules non transfectées avec des antcorps anti SIRT1 et PG1

Non, je ne pensais pas en faire deux. Le mieux c'est de le faire sur les protéines normales (sans transfection donc) si tu as des Ac contre tes 2 protéines comme ça t'es sûr de pas être gêné par les tag.
Mais au passage juste ton prof il veut que tu regardes la localisation et la fonction de tes prot chimères utilisées pour le BRET ou de tes prot normales ?
Mon problème, vu que je n'ai jamais fait d'immunohistochimie, c'est que je ne sais pas si en pratique on voit suffisemment les protéines exprimées par la cellule. Je pense que ça doit bien se voir mais ça dépend sans doute du taux d'expression de la protéine étudiée.
Donc si quelqu'un qui s'y connaît peut nous dire si l'expression endogène est suffisante poue la détection (ce que je pense) ou s'il vaut mieux faire une transfection (pour avoir plus de protéine détectable),ce serait sympa.

mais est ce que c'est pas préferable de cibler la même chose sur les deux immunohistochimie? et comparer la localisation et l'intensité de fluorescence

Oui c'est vrai que si t'as les Ac ça peut être aussi bien de cibler tes prot, mais ils vont aussi détecter la prot endogène (si elle est suffisemment exprimée pour être détectée), donc tu auras un mélange.
Mais bon, juste par curiosité moi j'aimerais bien comparer aussi pour voir si tes tag perturbent la localisation de tes prot.

donc cela serait suffisant pour voir si la proteine chimérique modifie les fonctions endogènes selon toi?

Clairement non. Il faut que tu fasses d'autres expériences pour ça.
Tu peux nous en dire plus sur la fonction de tes protéines pour qu'on puisse t'aider sur ce point ?

[A voir en vidéo sur Futura]