Problème : bande perdue avec QIAQUICK Gel Extraction Kit !

[invite09d67ed7]

¡Holá todo el mundo!

Bon, je poste ici mon premier message important.

Voilà une semaine que je me casse les dents sur le QIAQUICK Gel Extraction Kit de QIAGENE.

Je dois faire des PCR (pour produire un amiARN, bon, passons) dont les produits sont de petite taille : environ 200pb. Une fois les poduits déposés sur un gel d'agarose à 2% et soumis à un courant électrique pendant X temps, j'obtiens mes bandes. Malheureusement, elles ne sont pas seules (ca aurait été trop simple !), donc je dois découper celles qui m'intéressent et purifier l'ADN contenu. J'utilise pour cela le kit énoncé dans le titre.

Le problème est qu'après cette purification, en suivant le protocole A LA LETTRE, je n'obiens que très très peu d'ADN (alors que sur le gel, j'avais de très jolies bandes bien voyantes), de l'ordre de 20ng/uL à peine, et une analyse spectro me donne un grand pic à 225nm environ.

Mon gel étant à 2%, je l'ai fait fondre dans 5 volumes de tampon QG au lieu de 2 (recommandé pour les gels de 1%), j'ai bien éliminé tout le tampon PE et j'ai élué mon ADN dans de l'eau distillée stérile (20uL seulement).

Là je vais essayer de l'éluer dans du tampon EB, et de le repasser plusieurs fois dans la colonne. Je vais aussi tenter de faire migrer mes amplicons sur des gels à 1% pour voir si ca change quelque chose.

Tout ça pour dire que c'est assez frustrant, je ne sais plus trop quoi faire, donc si vous avez des suggestions qulelconques, je suis preneuse !
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[invitee6f8b455]

Bien pratique ces systèmes... quand ça marche
Alors voici mon avis. Par contre, je te précise que je le dit comme cela au hasard, je ne suis pas sûr que cela changera quelque chose.
Si tu en as la possibilité, essaie de faire plusieurs réactions de séquences pour découper ton gel avec plus de matériel.
Après, je pense que utiliser 2 volumes de QG pourrait suffir quitte à laisser plus longtemps l'agarose fondre (genre 15min à 50° au lieu des 10)
Et enfin, pour l'élution, essayer de le faire dans un plus petit volume. Que ce soit de l'eau, le tampon EB ou même du TE, je ne suis pas sûr que ça changera quelque chose...
Enfin bon, peut-être que ça ne changera rien mais c'est ce que j'aurai tenté...

[MaliciaR]

Et enfin, pour l'élution, essayer de le faire dans un plus petit volume. Que ce soit de l'eau, le tampon EB ou même du TE, je ne suis pas sûr que ça changera quelque chose...
Enfin bon, peut-être que ça ne changera rien mais c'est ce que j'aurai tenté...

Pour cette étape, j'avais changé le tampon EB avec du TE pour tous les protocoles d'extraction et purification que j'ai. Et puis, souvent dans les protocoles Qiagen tu peux trouver un conseil d'attendre 1 min avant de centrifugier.

En revanche, je ne sais pas si l'autre conseil de Yeast (éluer avec moins de tampon) est aussi bon . Je crois qu'il y avait eu un papier technique où les gars montraient (dans le cadre d'une purif' sur colonne) qu'éluer 2 fois avec 50 ul d'EB ne te faisait gagner que 8% d'ADN en plus par rapport à une élution unique avec 100 ul.
Après, je dis ça, ce n'est qu'une info dans un cadre précis... Je ne sais pas si l'on peut généraliser.

Enfin, tu sais, la lyophylisation existe aussi Il m'est arrivé de concentrer des échantillons de la sorte, c'est efficace


Cordialement,

[invite09d67ed7]

Merci beaucoup pour vos idées !

A vrai dire, les purifs que j'obtenais contenaient de l'ADN, mais trop peu selon moi (au maximum 20ng/uL), et après en avoir discuté avec des collègues qui avaient déjà tenté la même manip que moi, elles m'ont dit que le peu que j'obtenais était normal car elles mêmes avaient obtenu la même chose et que cela fonctionnait quand même pour la PCR finale O_o

Soulagée (ca faisait 4 jours que je refaisais PCR sur purif, purif sur PCR), je suis allée tester ça (la PCR finale est en route).

M'enfin quand même, obtenir si peu d'ADN avec de si belles bandes, ça m'étonne vachement de la part de ce kit...

Merci encore pour vos réponses, je pense que l'idée de concentrer au maximum l'ADN par ces divers moyens est à tester pour la prochaine fois

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitee6f8b455]

En revanche, je ne sais pas si l'autre conseil de Yeast (éluer avec moins de tampon) est aussi bon . Je crois qu'il y avait eu un papier technique où les gars montraient (dans le cadre d'une purif' sur colonne) qu'éluer 2 fois avec 50 ul d'EB ne te faisait gagner que 8% d'ADN en plus par rapport à une élution unique avec 100 ul.
Après, je dis ça, ce n'est qu'une info dans un cadre précis... Je ne sais pas si l'on peut généraliser.

Possible que cela ne change rien, je suggérais de l'essayer mais sans convictions
C'est vrai que ce kit est super pratique mais le rendement peut parfois paraitre très faible. Maintenant, c'est vrai que si tu refais une PCR dessus, ça devrait être bon. Dans mon cas, je faisais cette purif après une restriction et avant une ligation ce qui nécessite un peu plus de matériel

[invite13e8d755]

Tout d'accord avec Yeast. Ce kit n'est pas à conseiller.