problème avec kit ELISA

[invite7fbb006d]

bonjour,

j'ai un problème pour faire un ELISA quantitatif, il faut dire que je suis pas expérimenté dans le domaine et que je fais tout à la main (pas d'automate). En fait j'ai deux problèmes.

- je fais toutes mes analyses en double mais aucun doublon n'est correct. L'absorbance varie du double au triple alors qu'elle devrait être la même.

- autre problème : Je fais un blanc, sans apport de la protéine à doser. Malgré ça à la dernière étape, lorsque j'apporte le substrat de l'enzyme, j'ai une coloration et pas des moindre.

Je lance un appel aux personnes expérimentés dans l'ELISA quantitatif ou ayant déjà rencontré ce type de problèmes. Merci pour vos réponses.
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[inviteea96b0bf]

très naivement je te demenderai si tu es sur de ton lavage ...
sinon oui j'ai hate d'avor des réponses car c'est troublant ...

[gorben]

Salut,

Tu as peut etre un tampon contaminé, tu as essayé de changer tous tes tampons?? et de repreparer tous tes echantillons depuis le debut?

A+

[invite7fbb006d]

je ne suis pas sûr de mon lavage car j'aspire les solutions de lavage, on m'a dit qu'il valait mieux retourner la plaque et tappoter sur du papier absorbant. En plus je n'ai pas de pipette multicanaux donc j'ajoute la solution de lavage une par une.

[A voir en vidéo sur Futura]

[inviteea96b0bf]

ben pourquoi ne pas commencer par refaire juste un control blanc avec le lavage "classique" ...
apres si ca te donne le meme résultat, regarde comme la dit gorben du coté du tampon. Et si tu fais tout "a la main" t'es sur de tes anticorps ?

[invite7fbb006d]

je refais une manip en ce moment, j'ai changé ma façon de faire. on va bien voir.

[inviteea96b0bf]

tiens nous au courant

[invite7fbb006d]

j'ai refais la manip, le blanc est correct, il ne s'est pratiquement pas coloré. Par contre j'ai testé 2 échantillons, il y en a un qui a donné un doublon trés correct et l'autre qui a donné un doublon complètement à côté. Du style en absorbance j'ai 0,1 et 0,8. Alors que je devrai avoir la même absorance. J'ai tout fais correctement, je ne comprend rien.

[invite7fbb006d]

petite question : est ce que vous avez l'habitude de mettre de la BSA dans votre tampon de dilution?

[Jean-Luc P]

A priori c'est courant, mais je ne comprends pas précisément de quel tampon de dilution tu parles.

[invite7fbb006d]

je m'explique, ma protéine est lyophilisée, je pèse une quantité x, par exemple 1 mg. J'effectue par la suite des dilutions jusqu'à arriver à la concentration de quelques ng/ml, ceci afin d'être dans la courbe d'étalonage. Pour faire ces nombreuses dilutions j'utilise de l'eau distillée. Etant donnée la faible concentration de la protéine à la dernière dilution (quelques ng/ml) je me demande si elle ne se fixe pas sur les parois du verre car il y a des puits où je ne détecte rien. Donc je me dis qu'il faut peut etre mettre de la BSA.