Les mystères de la PCR

[invite89902e9c]

Bonjour à tous,
J'ai une question qui va peut être paraître idiote mais bon, alons-y.
Je m'explique. Je fais des PCR régulièrement pour génotyper des souris. Jusqu'à lundi, je n'avais aucun problème et là, boum, pas de bandes sur mon gel d'agarose. Au final, je me rend compte que je me suis bêtement trompé de concentration de dNTPs. En fait j'en ai mis trop (problème de solution mère faite un lundi trop tôt ...).Trop concentré, mais sans modification de volume final.
Alors la question c'est : pourquoi un excès de dNTPs inhibe la réaction de PCR ? Parceque là, je ne vois pas.
Je précise que tous les contrôles ont été faits pour être sur que c'était bien ça le souci.
Alors si quelqu'un peut lever ce mystère...
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[invite6d58978b]

Bonjour

Info à vérifier mais je crois qu'un excès de dNTP chelate les ion Mg2+.

Cordialement.

Toyeux.

Edit: http://www.med.univ-rennes1.fr/wkf/s...rgPCR_2008.pdf

Regarde page 16

[invite89902e9c]

Et voila, ce fut un bien petit mystère....
Merci beaucoup pour la réponse et pour le lien.
Amicalement,
Shedûn.

[invite10adf645]

Ca m'était arrivé aussi en début de DEA. Puis on m'a demandé si j'avais bien dilué mes dNTP au 1/10...

N'empèche que l'effet d'inhibition totale de la PCR que peut avoir une concentration trop forte en dNTP était restée mystérieuse pour moi.

merci à vous deux pour avoir posé la question, et pour y avoir répondu !

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea0443c8c]

Un excès de dNTP inhibe la polymérase...

V.

[invited193aaa7]

Bonjour,
dans mon labo il ne rajoute jamais de MgCl2 et nous avons que des smears ou rien lors de nos pcr, c'est possible que sa vienne de cela? le problème c'est que sur les memes échantillons tout marché super bien avant !

[invite6d58978b]

Bonjour.

Ton ADN polymerase a besoin de MgCl2 pour fonctionner correctement donc effectivement cela peut venir de ça.

Néanmoins, de nos jours, je crois que tous les tampons PCR présent dans les kits en contiennent un minimum.
(Perso j'achète chez qiag*n ou stratage*e et j'ai mon tampon PCR + un tube de MgCl2 au cas ou je voudrai en rajouter.)

Après si vous achetez pas de kit, peut être que.....

Cordialement.

Toyeux.