comment faire une mutation par PCR?

[invitefacf5a61]

Salut Double D,
peux-tu me faire suivre ton protocole detaille ? ce serait sympa surtout si tu en fais de routine.
merci et a bientot!
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[invitefacf5a61]

Salut

J'interviens dans cette discussion, parceque de la mutagenèse dirigée j'en fait tous les jours et ça marche très bien. C'est rapide et efficace.

Nous on amplifie le plasmide entier et le mien fait à peu près 7kb. Donc pour le tien y a pas de problème.

On choisit les amorces de manière à mettre 11nt de chaque côté de la mutation introduite. Avec cette technique, on a déjà introduit 23nt au même endroit (c'est moins facile) mais pour changer un seul nt, ça marche à tous les coups.

Ensuite, PCR avec la Pfu en comptant 2mn d'élongation par kb (du coup on fait sur toute la nuit).

Le lendemain matin, je digère avec DpnI et je transforme ensuite directement DH5a avec 10ul du produit de PCR.

Y a plus qu'à screener les colonies, et ça marche très bien.

Le kit commercial c'est de stratagène, le quick site exchange.

Mais on peut se contenter d'acheter la Pfu, vu que je pense que tout le monde a des enzymes par un fournisseur dans son labo. Du coup ça revient moins cher.

J'ai deja commande les amorces mais les miennes ont 21nt de part et d'autre de la mutation que je veux introduire, penses-tu que je peux les utiliser quand meme ou dois-je en commender d'autres?
merci encore pour votre aide

[invite7825c20b]

salut

21 nt de chaque côté, je pense que ça doit marcher aussi.

Pour le protocole, je le met ici, ça peut intéresser des gens:


Utilisation de l’enzyme Pfu Turbo de chez Stratagène.

Pour une réaction

5 ?l de Tampon 10X
1 ?l d’un mix de dNTP à 10 mM chacun
1 ?l de primer 1 à 100 ?M
1 ?l de primer 2 à 100 ?M
1 ?l d’enzyme Pfu Turbo (2,5 u/?l)
100 ng d’ADN (en pratique, 1 ?l d’une miniprep)
H2O qsp 50 ?l

Pour la réaction :

95°C 2 mn

puis 20 cycles
95°C 30s
48°C 30s
68°C 2mn/kb

68°C 10 mn (ou le temps de l'élongation)
12°C jusqu’à récupérer le tube

Remarque :
Pour l’hybridation des amorces, je prends cette température quelque soient les Tm, qui de toute façon sont beaucoup plus élevés. En général, amorces de 22nt avec le résidu muté au milieu.
.

Après la réaction
Ajout de 1?l de DpnI. Toute la journée à 37°C.

Transformation de DH5? avec 10 ?l du produit de PCR

Voilà, j'espère que ça va marcher pour toi.

[invite0e9887ab]

Hello !


Elle est intéressante cette autre technique. Je reste sceptique du point de vue des mutations mais si ça marche pour d'autres ça doit être bon.
J'ai juste une petite question.
Après digestion du produit pcr, on transforme direct. Le plasmide se referme comment ? Dans les DH5a ?
J'ai le sentiment d'avoir louper un truc ^^

Dans tous les cas, bodum, donnez-nous des nouvelles !

A ++

[invitefacf5a61]

salut

21 nt de chaque côté, je pense que ça doit marcher aussi.

Pour le protocole, je le met ici, ça peut intéresser des gens:


Utilisation de l’enzyme Pfu Turbo de chez Stratagène.

Pour une réaction

5 ?l de Tampon 10X
1 ?l d’un mix de dNTP à 10 mM chacun
1 ?l de primer 1 à 100 ?M
1 ?l de primer 2 à 100 ?M
1 ?l d’enzyme Pfu Turbo (2,5 u/?l)
100 ng d’ADN (en pratique, 1 ?l d’une miniprep)
H2O qsp 50 ?l

Pour la réaction :

95°C 2 mn

puis 20 cycles
95°C 30s
48°C 30s
68°C 2mn/kb

68°C 10 mn (ou le temps de l'élongation)
12°C jusqu’à récupérer le tube

Remarque :
Pour l’hybridation des amorces, je prends cette température quelque soient les Tm, qui de toute façon sont beaucoup plus élevés. En général, amorces de 22nt avec le résidu muté au milieu.
.

Après la réaction
Ajout de 1?l de DpnI. Toute la journée à 37°C.

Transformation de DH5? avec 10 ?l du produit de PCR

Voilà, j'espère que ça va marcher pour toi.

ca marche aussi si je prends la Platinium Taq Polymerase au lieu de la turbo?
For sur je vous laisse savoir les resultats, alors si tout va bien rdv 2eme semaine de decembre les amis !
merci a tous

[invite7825c20b]

Hello !

J'ai juste une petite question.
Après digestion du produit pcr, on transforme direct. Le plasmide se referme comment ? Dans les DH5a ?
J'ai le sentiment d'avoir louper un truc ^^

Dans tous les cas, bodum, donnez-nous des nouvelles !

A ++

Salut
ça c'est la question qu'on se pose tous au début. En fait c'est la bactérie qui fait le boulot après transfo, elle répare les nicks.

Pour la Platinium Taq Polymerase, je connais pas cette enzyme. Mais j'aurais tendance à penser que n'importe quelle enzyme proofreading (et qui ajoute pas de A) capable de faire des longs fragments peut convenir.