Bonjour tout le monde,
Je dois introduire une mutation dans un gene (remplacer le TCC par un AGC) par PCR, je n'ai jamais fait une telle chose. L'un d'entre vous pourrait-il m'aider et me guider sur la procedure/le protocole a suivre?
mille merci et bonne chance a vous dans vos manip,
Bodum
euh c'est dur ton truc . avec une pcr sa me parait impossible . normalment pour introduire des sequence d'adn faut utilisé des retrovirus je crois. a ta place je couperai de l'adn simple brin avec une endonuclease et j'y ajouterai ta sequence grace a une liase puis je lamplifirai avec une pcr. mais je pense que tous sque jvien de te dire ces des connerie lol .
Salut,
Chez les procaryotes ou eucaryotes? chez les procaryotes je peux t'aider. Par contre pour les eucaryotes j'ai aucune experience. De toute maniere d'un cote ou de l'autre ca se fera par "recombineering". Tu peux chercher ce terme sur pubmed ou google, tu auras deja pas mal d'idee.
A+
Ben en fait je ne veux pas introduire une nouvelle sequence je voudrais remplacer un codon par un autre pour empecher une structure de se former. Il me semble que j'ai deja entendu parler de mutations par PCR, de toute facon mes boss me demandent d'utiliser cette methode. Mais bie sur ils n'ont pas de protocole...Envoyé par mrle13
So je me demande comment faire, j'ai chercher sur le net, mais je ne trouve pas.
Bonjour,
La mutation doit etre introduite dans le gene XBP1 qui se trouve dans un plasmide de type adenovirus.
Je vais chercher sur pubmed ce que je trouve sous ce terme, mais je ne pense pas que c'est exactement ce que je cherche, mais je vais quand meme jeter un coup d'oeil,
Many thanks!
Si si c'est parfaitement ce que tu cherches. Tu vas trouver pleins de truc grace a ce terme.
A+
ouai tu coupe les deux extremité avec une endonuclease et tu introdui entre les deux ton codon . c'est sa que je voulai te dire
Bonjour a tous,
apres plusieurs recherches/lectures j'ai trouve THE protocole, alors je le partage avec vous.
Si la sequence est XXX-XXX-XXX-XXX-XXX-XXX-XXX-TGT-XXX-XXX-XXX
et qu'on veut remplacer le TGT par GGT
1/ designer les primers F et R qui contiennent la dite mutation so primer F: XXX-...-GGT-...
primer R: XXX-...-CCA-...
2/ runer un PCR, la majore partie des primers sera annealier et donc pas d'extension par la Taq, mais une petite partie va targeter la sequence avec un petit mismatch.
La polymerase va lire tout autour du plasmide et ainsi incorporer l'erreur.
qu'est ce que vous en penser je peux truster?
merci et bonne journee a vous tous,
Bodum
question qui peut paraitre stupide, but anyway je la pose quand meme, il faut surement que j'ouvre mon plasmide avant le PCR, n'est-ce pas?
many thanks !
Bodum
Non, cela n'est pas nécessaire.
Si j'ai bien compris ce que vous désirez faire, il s'agit en français d'une mutagenèse dirigée.
C'est assez simple à réaliser.
Tout d'abord, il faut faire deux premières pcr (sur le plasmide, pas besoin de le linéariser) de part et d'autre du codon à muter mais qui le chevauchent.
Ce qui permet d'amplifier deux segments qui doivent chacun contenir un site de restriction unique dans le plasmide (attention, différent du site qu'on désire insérer évidemment).
Chacun des segments se termine par la zone mutée grace aux primers qui ont servis à l'amplification. Ces primers ont été designés pour ce coller parfaitement à la séquence excepté au niveau du codon TCC qui serait remplacé par AGC.
Ensuite, il faut refaire une pcr en utilisant le résultat des deux pcr précédentes comme template et les amorces non mutées qui encadrent donc la région mutée et qui comprennent les deux sites de restriction.
Enfin, par simple clonage, on insère le résultat de cette pcr dans le plasmide initial grâce aux sites de restriction unique.
J'ai joint une image qui schématise bien la méthode. J'espère qu'elle va s'afficher
[QUOTE=Dizaall;2032477]Non, cela n'est pas nécessaire.
Si j'ai bien compris ce que vous désirez faire, il s'agit en français d'une mutagenèse dirigée.
C'est assez simple à réaliser.
Bonjour Dizall,
je suis largee, sorry perdue, pourquoi je dois faire 2 PCR, je pensais que je devais en faire juste une seule en mettant le plasmide, les amorces F et R et le stuff pour PCR.
Cette premiere PCR me permet d'obtenir le fragement qui sera mute et ensuite je peux refaire une seconde PCR avec les meme amorces mais cette fois pour amplifier le petit nombre de plasmides qui auraont la mutation, c'est ca?
Ce qui permet d'amplifier deux segments qui doivent chacun contenir un site de restriction unique dans le plasmide (attention, différent du site qu'on désire insérer évidemment). La aussi je suis perdue, je comprends pas, l'histoire du site de restriction. Comment je fais pour savoir pour mon site de restriction?
Ensuite, il faut refaire une pcr en utilisant le résultat des deux pcr précédentes comme template et les amorces non mutées qui encadrent donc la région mutée et qui comprennent les deux sites de restriction. alors la c'est definitif je suis dans le champs, je vais attendre que l'image soit validee pour voir si ca m'eclaire
Merci pour le complement d'info, ca me semble plus complique que ce que j'avais initialement compris
Bodum
[QUOTE=bodum;2032504]He bien, en fait, j'espérais que mon schéma s'afficherait. C'est pas simple à expliquer par écrit, mais avec le schéma, en général, tout s'éclaire.Non, cela n'est pas nécessaire.
Si j'ai bien compris ce que vous désirez faire, il s'agit en français d'une mutagenèse dirigée.
C'est assez simple à réaliser.
Bonjour Dizall,
je suis largee, sorry perdue, pourquoi je dois faire 2 PCR, je pensais que je devais en faire juste une seule en mettant le plasmide, les amorces F et R et le stuff pour PCR.
Cette premiere PCR me permet d'obtenir le fragement qui sera mute et ensuite je peux refaire une seconde PCR avec les meme amorces mais cette fois pour amplifier le petit nombre de plasmides qui auraont la mutation, c'est ca?
Ce qui permet d'amplifier deux segments qui doivent chacun contenir un site de restriction unique dans le plasmide (attention, différent du site qu'on désire insérer évidemment). La aussi je suis perdue, je comprends pas, l'histoire du site de restriction. Comment je fais pour savoir pour mon site de restriction?
Ensuite, il faut refaire une pcr en utilisant le résultat des deux pcr précédentes comme template et les amorces non mutées qui encadrent donc la région mutée et qui comprennent les deux sites de restriction. alors la c'est definitif je suis dans le champs, je vais attendre que l'image soit validee pour voir si ca m'eclaire
Merci pour le complement d'info, ca me semble plus complique que ce que j'avais initialement compris
Bodum
Je viens de retenter une explication mais là...
Franchement, il vaut mieux attendre le schéma. Après on verra si vous avez encore des questions
Le problème c'est de réinsérer ensuite le fragment muté par pcr dans le plasmide. Ce n'est possible que si on fait deux étapes de pcr.
[QUOTE=bodum;2032504]Salut,Non, cela n'est pas nécessaire.
Si j'ai bien compris ce que vous désirez faire, il s'agit en français d'une mutagenèse dirigée.
C'est assez simple à réaliser.
Bonjour Dizall,
je suis largee, sorry perdue, pourquoi je dois faire 2 PCR, je pensais que je devais en faire juste une seule en mettant le plasmide, les amorces F et R et le stuff pour PCR.
Cette premiere PCR me permet d'obtenir le fragement qui sera mute et ensuite je peux refaire une seconde PCR avec les meme amorces mais cette fois pour amplifier le petit nombre de plasmides qui auraont la mutation, c'est ca?
Ce qui permet d'amplifier deux segments qui doivent chacun contenir un site de restriction unique dans le plasmide (attention, différent du site qu'on désire insérer évidemment). La aussi je suis perdue, je comprends pas, l'histoire du site de restriction. Comment je fais pour savoir pour mon site de restriction?
Ensuite, il faut refaire une pcr en utilisant le résultat des deux pcr précédentes comme template et les amorces non mutées qui encadrent donc la région mutée et qui comprennent les deux sites de restriction. alors la c'est definitif je suis dans le champs, je vais attendre que l'image soit validee pour voir si ca m'eclaire
Merci pour le complement d'info, ca me semble plus complique que ce que j'avais initialement compris
Bodum
Les deux methodes sont viables, la tienne est plus rapide, plus simple que celle de Dizaal, mais en revanche faire une amplification de la totalite du plasmide risque de generer des erreurs aux endroits ou tu ne veux pas en avoir. Si ton plasmide est petit ca peut le faire, mais s'il est grand c'est presque impossible (probabilite d'erreur plus grande, voire PCR impossible si le plasmide est vraiment grand)
A+
j'ai peut-etre mieux compris en faisant un dessin, ok pour la premiere PCR qui me permet d'obtenir 2 doublets de mon plasmide un fait a partir de la sequence F et l'autre a partir de la R.
Ensuite seconde PCR pour amplifier le petit nombre de plasmides qui contiennent la mutation (vu que la majorite des primers va s'annihiler, il faut amplifier le petit nombre de primers qui sont parvenus a se fixer sur le plasmide et etre utilises par la Pol.
J'ai lu que si je veux muter un codon, je dois faire des primers avec 21 nucleotides en amont er 21 en aval de mon codon mute pour etre sur que le primer puisse se fixer. Alors je ne comprends pas comment les segments qui contiennent le site de restriction peuvent se terminer par la codon mute vu que le codon est entre 21 nucleotides de part et d'autre.
Parenthese, mais je trouve ca vraiment super de pouvoir discuter avec vous et d'avoir des conseils qui plus est en francais ! merci +++++++ plein de fois
Bodum
Mon image a été acceptée même si le format n'est pas top.
Tes amorces seront en effet plus longues que normal, mais ce n'est pas grave. Il faut adapter la T° d'hybridation.
Je peux te refiler le protocole que j'ai pour que tu saches combien d'ADN engager à chaque étape.
Gorben a raison, prends bien garde aux mutations. Ne choisi pas un insert trop grand car cela augmenterait le risque et utilise une high figelity.
On n'amplifie pas le plasmide en entier évidemment. Ce serait de la folie, sauf s'il est vraiment très petit.
Au final, on amplifie vraiment de petites régions pour limiter le temps des pcr et le nombre de mutations.
Ensuite, seulement, on insère le tout dans le plasmide par simple clonage. Cela n'implique donc aucune pcr ce qui limite fortement le risque de mutation.
[QUOTE=gorben;2032552]Salut Gorben,
Oui c'est bien ce que je crains aussi.. mon plasmide fait en peu plus de 4.1kb so j'ai pas le choix de faire la methode Dizaal ?
Anyway, je vais faire me patiente et attendre le dessin, je vais peut etre comprendre. Mais je bug sur le site de restriction parait que l'enzyme DpnI est une 4-cutter du dam methylated DNA, so je peux regarder si j'ai ce site ?
merci et a+
[QUOTE=gorben;2032552]Salut Gorben,
Oui c'est bien ce que je crains aussi.. mon plasmide fait en peu plus de 4.1kb so j'ai pas le choix de faire la methode Dizaal ?
Anyway, je vais faire me patiente et attendre le dessin, je vais peut etre comprendre. Mais je bug sur le site de restriction parait que l'enzyme DpnI est une 4-cutter du dam methylated DNA, so je peux regarder si j'ai ce site ?
merci et a+
[QUOTE=bodum;2032588]Les sites de restriction permettent de réinsérer le fragment muté dans le plasmide après la mutagenèse.
La mutagenèse permet d'obtenir un court segment de séquence comprenant la région mutée. Il faut ensuite remettre cette séquence dans le plasmide d'origine, à la place du petit segment non-muté. Le meilleur moyen de le faire c'est par simple clonage grâce à des enzymes de restriction.
Ensuite, c'est comme dans n'importe quel clonage, il faut transformer le produit de ligation et amplifier les bactos.
Sans oublier de séquencer après tout ça.
Oui je veux bien ton protocole pour avoir une idee, ce serait super nice !
Donc en fait il faut que je redesgne mes primers pour faire comme dans ton image (super claire en passant merci!) ?
Ils doivent etre de combien de nt de long?, la distance entre le 1 et le 3 ou le 2 et le 4 doit-elle etre precise ?
Je pense qu'avec ta methode je devrai avoir moins de trouble cote mutation. Pensez vous que si je me limite a 12 cycles de PCR c'est bien pour minimiser les chance d'expanding mes PCR sequence error?
merci
[QUOTE=Dizaall;2032606]ok, alros pour mes amorces 3 et 4 il faut que je fasse attention a chevaucher un site de restriction de preference a bouts francs ? pour une fois mon doublet final obtenu pouvoir le remettre dans mon plasmide.
C'est trop merveilleux la BM quand on nous explique !
Pour le protocole comment on fait tu me le fais suivre sur le forum?
merci a tout le monde, et bonne fin de journee ou debut selon l'endroit ou vous etes !
[QUOTE=bodum;2032617]Non, je te conseille de prendre les amorces 3 et 4 plus loin que les sites de restriction.
D'une part, parce que les enzymes préfèrent avoir de la place pour couper. "Elles n'aiment pas se trouver au bord du vide".
Et d'autre part parce que cela te permettra de vérifier si elles ont bien coupé car le fragment sera alors plus court.
La distance, peu importe. C'est en fonction des sites dont tu disposes. Le plus court possible, ça limite les risques de mutation, co d'hab.
Heuu je vais voir comment faire pour le protocol.
[QUOTE=Dizaall;2032623]Si ca marche je vous fais parvenir des macarons Laduree!! lol
merci encore
Oui, c'est ce qu'ils disent dans mon protocol. Mais moi, pour avoir suffisament de matériel, j'en faisais aux alentours de 29 et cela avait fonctionné.
Mes amorces étaient de 21 à 29 nt car j'avais pas mal à muter.
[QUOTE=bodum;2032634]miam, ce serait bien ça.
Mais je ne suis pas certaine qu'ils résistent au voyage.
ps : Pour le protocole, je verai ça ce soir car il est en format .doc je ne sais pas comment je pourrais l'envoyer.
Tu as aussi un kit "quickchange" qui fait ca tres bien et tres simplement (desole je ne me rappelle plus la marque). 4.1 Kb c'est plutot petit pour un plasmide. Il y a peu de chance que tu ais des mutations si tu utilises une enzyme fidele (genre pfu, phusion...)
A+
je prends tout ca en note et des que j'ai les premieres data, je vous donne un feedback.
merci encore, a+ itoo !
4.1kb ? Sans mutation ? Même avec une high fidelity c'est chaud. Surtout que cela dépend aussi du locus. Si tu as le malheur de tomber sur un locus qui s'amplifie difficilement tu es mal barre...
Salut
J'interviens dans cette discussion, parceque de la mutagenèse dirigée j'en fait tous les jours et ça marche très bien. C'est rapide et efficace.
Nous on amplifie le plasmide entier et le mien fait à peu près 7kb. Donc pour le tien y a pas de problème.
On choisit les amorces de manière à mettre 11nt de chaque côté de la mutation introduite. Avec cette technique, on a déjà introduit 23nt au même endroit (c'est moins facile) mais pour changer un seul nt, ça marche à tous les coups.
Ensuite, PCR avec la Pfu en comptant 2mn d'élongation par kb (du coup on fait sur toute la nuit).
Le lendemain matin, je digère avec DpnI et je transforme ensuite directement DH5a avec 10ul du produit de PCR.
Y a plus qu'à screener les colonies, et ça marche très bien.
Le kit commercial c'est de stratagène, le quick site exchange.
Mais on peut se contenter d'acheter la Pfu, vu que je pense que tout le monde a des enzymes par un fournisseur dans son labo. Du coup ça revient moins cher.
