Résultats d'un criblage biologique...

[Bimini]

Bonjour à tous,

J'ai lu sur un site :
"Pour visualiser les réactions issues de la mise en contact, dans les puits, de la molécule et de la cible, on utilise des méthodes basées sur la radioactivité ou, bien souvent, la fluorescence."

En quoi consiste brièvement ces méthodes ?
On ajoute un produit dans le mélange des molécules testées et des cibles biologiques et si ça brille, cela signifie qu'il y a réaction ?

Ne peut-on tout simplement pas voir les réactions des molécules sur la cible grâce à un microscope électronique ?

Merci d'avance pour vos réponses,

Michaël.
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[invite8c0cc995]

Bonjour à tous,
Ne peut-on tout simplement pas voir les réactions des molécules sur la cible grâce à un microscope électronique ?

C'est peut être là le problème ! Je ne pense pas qu'il soit si simple que cela en microscopie électronique de voir une interaction protéine-protéine. Peu de labo sont équipés de tels microscopes, alors que des lecteurs de plaques en fluorescence ou des detecteurs de radioactivité sont nettement plus fréquents, et moins chers.

Cordialement,

[vpharmaco]

Bonsoir,

Pour revenir sur les methodes, c'est en général des tests de compétition : on fixe la protéine d'intéret sur une microplaque et on regarde la capacité des molécules à empêcher la liaison entre la proteine et un ligand de la proteine qui est marqué soit par un élément radioactif, soit avec une sonde fluorescente.
Après lavage, plus la radioactivité/fluorescence restante est faible, plus la molécule testée est un bon inhibiteur.

Rq: on peut également faire ce genre de test en solution (cf sur Wikipédia polarisation de fuorescence/FRET)

Après, pour ce qui est de la microscopie électronique : elle n'est pas suffisament résolutive pour voir la liaison d'une petite molécule et ce n'est pas une méthode quantitative.

[Bimini]

Bonsoir,

Merci à tous les deux pour vos réponses. "Ligand" était le mot magique qui m'a permis d'approfondir... Je pose ces questions pour les besoins d'une histoire qui se passe dans un futur éloigné, ce qui ne devrait pas poser de problème pour le coût et la résolution d'un microscope électronique. Cela dit, le fait que cela ne soit pas une méthode quantitative, la fluorescence me plait bien. Donc...

En poussant mes recherches, j'ai lu :
"mesure de la fluorescence émise, par polarisation de la fluorescence : le ligand lié étant moins mobile que le ligand libre, la polarisation permet de lire les résultats sans avoir à séparer le lié du libre."

Est-ce que cela veut dire qu'il n'y a pas besoin de passer par l'étape du lavage ?

Autre question... Quelle est l'unité de mesure de la fluorescence et, pour me donner une idée, quelles pourraient être les valeurs de ces mesures pour un très bon inhibiteur et un très mauvais inhibiteur ?

Encore merci,

Michaël.

[A voir en vidéo sur Futura]

[vpharmaco]

Est-ce que cela veut dire qu'il n'y a pas besoin de passer par l'étape du lavage ?

Oui, c'est l'intérêt principal de ce type de méthodes, qui permet d'éliminer les différentes étapes d'absorbtion de la protéine cible, saturation de la plaque, lavages .....

Autre question... Quelle est l'unité de mesure de la fluorescence et, pour me donner une idée, quelles pourraient être les valeurs de ces mesures pour un très bon inhibiteur et un très mauvais inhibiteur ?

euh..... l'unité je sais pas. Tu mesures une intensité lumineuse lors d'une expérience de fluorescence simple et un changement de polarisation (sans unité, c'est un ratio) en polarisation de fluorescence.
Quoi qu'il en soit, lorsqu'on fait un crible, la valeur du signal n'est pas importante. On compare toujours la valeur obtenue avec l'inhibiteur par rapport à un contrôle positif (sans inhibiteur - signal max) et un contrôle négatif (sans ligand marqué - signal min) et on obtient ainsi un pourcentage d'inhibition.

Je pose ces questions pour les besoins d'une histoire qui se passe dans un futur éloigné, ce qui ne devrait pas poser de problème pour le coût et la résolution d'un microscope électronique

Je pense que la microscopie ne permet pas intrinsequement de faire du criblage, meme dans 10000 ans ! il faut se rappeler, que l'on cherche à étudier un équilibre dynamique entre une molecule et un ligand pour se lier à une proteine, en solution. Vu le vide poussé qui règne dans un microscope, je ne vois pas comment cela pourrait etre possible !

[Bimini]

Bonjour à tous,

Merci vpharmaco pour ces précisions.

J'ai une dernière question pour savoir si j'ai bien compris.

On compare toujours la valeur obtenue avec l'inhibiteur par rapport à un contrôle positif (sans inhibiteur - signal max) et un contrôle négatif (sans ligand marqué - signal min) et on obtient ainsi un pourcentage d'inhibition.

Si lors d'un crible, la fluorescence est faible, voire quasiment inexistante, je me trouve en face d'un très bon inhibiteur.
Est-ce qu'on peut dire, par exemple, que la molécule testée a un pourcentage d'inhibition de 98 ?

A bientôt,

Michaël.

[vpharmaco]

Bonsoir,

Reponse rapide : oui

Réponse détaillée : on peut calculer un pourcentage d'inhibition de cette façon :
%inhibition = (valeur mesurée avec l'inhibiteur - valeur du controle neg)/(valeur du controle positif - valeur du controle neg) *100
En general les manip sont faites en triplicate (une condition identique est testée 3 fois), et on obtient donc des pourcentages d'inhibition avec un ecart-type.

[Bimini]

Bonjour vpharmaco,

Merci pour les informations que tu m'as apportées.
J'ai maintenant ce qu'il me faut pour ce sujet.

Les recherches pour mon roman m'ont amené à ouvrir d'autres discussions où il me reste des questions sans réponses.
Si le cœur t'en dit, voici les liens :
Virus ou bactéries, j'ai du mal à me décider. et ADNr 16S ou ARNr 16S ?

Alors peut-être à bientôt sur d'autres discussions.

Michaël.