Traitement phosphatase pour démontrer qu'une enzyme est phosphorylée

[invitee26a2058]

Bjr,

Je travail actuellement sur l'enzyme LDOX de la vigne. Par western blot nous nous sommes apercu que la réponse était double, deux bandes très proches sont identifiables à la révélation. D'autres résultats nous laissent penser que l'enzyme est phosphorylé dans certaines conditions et nous voudrions donc le démontrer. Nous avons penser à traiter nos échantillons avec une phosphatase et refere un western afin de voir si on obtenait toujours la meme réponse (2 bandes) ou seulement une bande ce qui irait dc dans le sens de nos supposition.
Le pb qui ce présente à nous porte sur le choix de la phosphatase à acheter. nous aimerions une phosphatase ayant une efficacité significative sur ce type d'échantillon. Si qqun pourrait nous éclairer sur le type de produit à acheter, chez quel fabricant ou toutes autres remarques constructive seront les bienvenu.
Cordialement!
-----

[inviteab9fd4ae]

Bonsoir,
Tu travaille sur culture celullaire ?
Si oui, As tu pensé à un traitement à l'ortho-vanadate (inhibiteur des phosphatases) à différents temps et différentes concentrations pour voir si ta réponse diminue.

Bon courage.

++

[invitee26a2058]

Je travail sur des extrait brut de protéines totales de baies.
A l'état normal la LDOX n'est pas phosphorylée, c'est le cas seulement dans certaines conditions. Je ne suis donc pas sure que la démarche proposé répondra au problème.
Merci quand meme pour cette réponse.

[invite19e2cc03]

et pourquoi ne pas essayer un western avc un anticorps dirigé contr la proteine totale et un autre dirige contre la protéine phosphorylée ? Ensuite faire la ration phospho sur total

[A voir en vidéo sur Futura]