Résultats de PCR

[inviteafc350b4]

Bonjour chers forumers,
me revoici avec encore un problème de PCR. J’ai préparé des plaques PCR 384 d’ADNc avec un témoin négatif d’eau RNAse free présent dans 96 puits répartis régulièrement sur toute la plaque. J’ai passé ces plaques en PCR à raison d’une tous les 2 jours. J’ai ensuite lancé ma PCR sur le light cycler 480 de ROCHE. J’ai ensuite fait mes analyses de résultats et c’est là que quelques observations m’ont perturbée :
- dans mes puits de témoin négatif, je n’ai pas de Cp (ou Ct) dans la plupart, mais pour 10 échantillons, j’ai un Cp de 22 à 35. Les puits concernés sont répartis sur toute la plaque, ils ne sont pas regroupés à un seul endroit.
- toujours dans les puits de témoin négatif, généralement, je n’ai pas de Tm sauf pour certains échantillons qui ont un Tm légèrement inférieur à celui indiqué pour les ADNc.
- pour les puits de témoin négatif où j’observe un Cp de 35, j’ai 2 valeurs de Tm, la seconde valeur étant généralement de 80.
J’ai distribué plusieurs plaques de PCR totalement identiques, dans le même après-midi car je réalise un test de conservation des plaques PCR à 4°C. Les observations de double valeur de Tm citées ci-dessus ont été réalisées sur les plaques J+2 et J+4 ; la plaque passée le jour même n’a qu’une valeur de Tm un peu faible et seulement pour quelques échantillons.

Mes questions sont donc : d’où viennent les Cp et les Tm de mes témoins négatifs ? Est-ce-que ça peut être une contamination ? Est-ce que cette contamination peut être due au robot qui m’a servi à distribuer les plaques (sachant que les puits concernés ne sont pas les mêmes d’une plaque à l’autre) ?

Je vous remercie d’avance de vos réponses.

Signé : la passionnée mais troublée stagiaire PCR
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[invite827d13c0]

Bonjour chers forumers,
me revoici avec encore un problème de PCR. J’ai préparé des plaques PCR 384 d’ADNc avec un témoin négatif d’eau RNAse free présent dans 96 puits répartis régulièrement sur toute la plaque. J’ai passé ces plaques en PCR à raison d’une tous les 2 jours. J’ai ensuite lancé ma PCR sur le light cycler 480 de ROCHE. J’ai ensuite fait mes analyses de résultats et c’est là que quelques observations m’ont perturbée :
- dans mes puits de témoin négatif, je n’ai pas de Cp (ou Ct) dans la plupart, mais pour 10 échantillons, j’ai un Cp de 22 à 35. Les puits concernés sont répartis sur toute la plaque, ils ne sont pas regroupés à un seul endroit.
- toujours dans les puits de témoin négatif, généralement, je n’ai pas de Tm sauf pour certains échantillons qui ont un Tm légèrement inférieur à celui indiqué pour les ADNc.
- pour les puits de témoin négatif où j’observe un Cp de 35, j’ai 2 valeurs de Tm, la seconde valeur étant généralement de 80.
J’ai distribué plusieurs plaques de PCR totalement identiques, dans le même après-midi car je réalise un test de conservation des plaques PCR à 4°C. Les observations de double valeur de Tm citées ci-dessus ont été réalisées sur les plaques J+2 et J+4 ; la plaque passée le jour même n’a qu’une valeur de Tm un peu faible et seulement pour quelques échantillons.

Mes questions sont donc : d’où viennent les Cp et les Tm de mes témoins négatifs ? Est-ce-que ça peut être une contamination ? Est-ce que cette contamination peut être due au robot qui m’a servi à distribuer les plaques (sachant que les puits concernés ne sont pas les mêmes d’une plaque à l’autre) ?

Je vous remercie d’avance de vos réponses.

Signé : la passionnée mais troublée stagiaire PCR

Bonjour,

Si les Tm ne correspondent pas au Tm de ta cible ,ce problème peux venir de tes amorces qui peuvent faire des homo ou hétéro imères. Si non c'est une contamination.

Nous avons constaté le même problème et c'est un peu aléatoire.