IPG strip gel combiner a une extraction au PBS

[invite5c7f90dc]

Bonjour a tous,

J'aimerais savoir si vous avez un protocole me permettant d'utiliser une extraction proteique au PBS (cellule vegetal, hypocotyl de soja) suivi d'une separation utilisant la methode IPG (pour ensuite effectuer une electrophorese et un CBB staining)

Je me suis renseigner dans le labo et apparement les problemes rencontres proviendrait d'un extrait proteique contaminer par des solutions utiliser pendant l'extraction classique au PBS.

Si vous avez une idee je suis preneur

Merci
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[inviteb6144ea4]

Bonjour,

je ne saisis pas: tu as déjà essayer et ça n'a pas marché? Qu'est-ce qui n'a pas marché? Quelles sont les solutions qui ont contaminées ton extraction d'après ton labo?

La méthode IPG n'aime pas les sels. Peut être devrais-tu envisager de dessaler ton extrait avant?

Cordialement

[invite5c7f90dc]

Merci pour une reponse aussi prompt.

Une personne dans le labo l'a deja essayer et son gel apres coloration etait ... vide, aucun spot (sauf un mais bon...), il a ensuite essayer en utilisant un kit de lavage de l'extrait proteique mais le resultat obtenu etait moin bon qu'une extraction PBS suivie d'une 1-D en tube gel.

L'extraction classique utilise un tampon phosphate pour le broyage initial, je doute que cela soit ca du fait des lavages, ensuite les proteines sont precipites avec du TCA, laver avec de l'ethanol et remis en solution avec un tampon dont je n'ai pas la composition sous le coude (je suis en stage donc je ne connais pas encore toute les solutions exactement).

Je vais me renseigner pour le dernier tampon

Cordialement

[inviteb6144ea4]

Bonjour,

question bête mais vous êtes-vous assuré que l'extraction avait bien marché? Avez-vous fait un dosage et déposé suffisamment de protéines pour l'IPG?

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[A voir en vidéo sur Futura]

[invite5c7f90dc]

Un dosage de type Lowri est effectuer avant chaque loading, car la quantite optimal de load pour l'IPG est 500ug il me semble, donc nous loadons 400ug pour etre sur de ne pas saturer le strip et un max de proteine sur le gel.
Donc l'extraction etait correct.

[inviteb6144ea4]

Bonjour,

si le dosage est bon, ok alors pas de problème à ce niveau là. Vérifiez bien quand même que le tampon de resuspension est bien compatible avec les réactifs du Lowry.
Vour pourriez peut être tenter également un coloration au nitrate d'argent qui est bien plus sensible que le bleu de Coomassie afin de voir s'il n'y a pas de spot du tout ou si la concentration en protéines est seulement juste un peu faible.
Et j'insiste sur les sels, c'est vraiment problématique pour les IPG.

Cordialement