Salut,
je suis entièrement d'accord avec Yoyo... quand c'est une manip' que tu fais souvent (genre clonage) c'est pas forcément nécessaire, sinon ça aide quand même... De plus la technique déjà citée plus haut qui consiste à déplacer le tube à chaque pipetage, c'est vraiment efficace
des touts ptits volumes... déja je me bat avec la pipette car ils ont pas de p2 mais je vais essayer de barrer au fur et a mesure!
Une derniere chose, pour une hybridation in situ, est ce que vous savez si ca "marche" quand meme si la sonde est un peu degradée?
Si tu as la possibilité d'écrire sur la paillase au marqueur (paillasse recouverte d'une plaque en verre!), ne t'en prive pas parce que ça peut te faire gagner du temps! Ca peut aussi t'aider pour, par exemple pour séparer 2 population de tubes (tu traces un trait au marqueur en identifiant ce qu'il y a à droite et à gauche du trait)!
Mais de toute façon c'est normal de faire des erreurs au début!
Et même plus tard je pense que ça arrive (mais moins souvent!)......le tout c'est d'être concentré sur sa manip! Certains travaillent en musique, ça peut aider à se concentrer mais ça ça dépend vraiment des gens!
Lorsque tu auras fait tra manip pendant quelques emaine toute seule, tu la connaitra tellement bien que tu pourra presque discuter avec quelqu'un tout en manipant (mais bon à ne pas essyer tout de suite!
A+
Vinc
Primum non nocere.
Ben ça dépend... Dégradée ? C'est-à-dire ? C'est quoi la sonde ?Envoyé par sophiepouick
PS: ça commence bien
bah, dsl je m'exprime peut etre très mal, je parle de la sonde ARN, et un peu dégradée car sur gel, il y en a un peu de tte les tailles, dc elle a été un peu "grignotée" par ces foutues RNAses!!!
Tu peux ecrire tes mots completements, il n'y a pas d'enzymes grignotant les lettres sur ce forum! Yoyo
Dernière modification par Yoyo ; 29/04/2005 à 19h33.
Si ta sonde est dégradée tu peux recommencer ta manip, car il n'y a pas de raison que la degradation s'arrete... tu finiras avace une solution de NTP pas tres pratique...
Yoyo
C'est clair, surtout avec les ARN
Re : Techniques utilisées en lab de biomol
Salut !
Finalement le lab a commencé beaucoup plus tot que prévuJ'ai pas eu de vacances ouinnn
Hier l'étudiant avec qui je travaille m'a dit qu'on commencerait par une maxi preps. On fait la manip et tout, et aujourd'hui on l'a terminé et on a regardé les résultats. Seulement voilà, on a pas les résultats escomptés. On arrive au final avec quelquechose comme 10 fois moins d'ADN que prévu. On sait pas ou ca a foiré
Bref, on recommencera lundi. J'en retire quand même une bonne chose : même un étudiant en doctorat peut se planter grave sur des manips qui sont jugés plutot simples ( hé oui, moi j'ai juste regardé et écrit, j'ai rien touché... tout du moins pour le moment).
Quelqu'un aurait une idée de ce qui peut faire qu'on obtient pas assez de plasmides sur une maxi preps? ( je sais, il peut y avoir beaucoup de raisons, mais lesquels mis a part le fait que la bactérie n'ai pas incorporé le plasmide avec insert? )
salut,
si les bacteries n'ont pas le plasmide elles ne pousseront, le fait que l'insert ne soit pas la n'a pas d'incidence sur la rendement de maxiprep.
Les causes les plus frequentes de foirages sont:
- pas assez de bacteries
- lyse incomplete
- perte d'une partie du culot apres precipitation a l'isopropanol.
Yoyo
Salut!
Oui, si ton plasmide n'a pas intégré l'insert, ta bactos va mourrir parce que dans le milieu de culture tu mets un antibiotique! Mais le vecteur que tu as inseré dans ta bactérie possède le gène de résistance à cet antibio ce qui permet de faire une première sélection antre bactos avec plasmide et bactos sans plasmide.
Ensuite, pour savoir si ton plasmide a intégré l'insert ou pas, tu utilises un autre système de sélection comme par exemple le Xgal et le gène LacZ.
Donc ce n'est pas parce que tu n'obtiens pas assez d'ADN d'intérêt que ta bactos n'a pas intégré le plasmide : elle a très bien pû intégré un plasmide vide (sans insert)!
A+
Vinc
Primum non nocere.
Hello
==> Yoyo et Vinc', il parle d'une maxi prép', je vois pas le rapport avec l'intégration de l'insert
Quel kit avez-vous utilisé ? Qiagen j'imagine. Relis bien l'index il est bourré de petits détails qui peuvent améliorer la manip'; ça peut dépendre de la taille du plasmide.
Sinon un problème récurrent est le lavage de la colonne qui se fait avec un tampon contenant plus de 70% d'éthanol, si il n'est pas bien fermé, l'éthanol s'échappe (en quelques heures) et au lieu de laver la colonne, tu élueston ADN; donc t'en perds une bonne partie. Un bon réflexe est de le conserver à 4 degrés.
edit: petit détail, si tu veux faire de la recherche, la 1ere chose à considérer, c'est d'oublier les vacances
L'autre possibilité est que le plasmide soit a bas nombre de copie, les rendements dans ces conditions sont assez faibles, beaucoup plus qu'avec un pUC qui se retrouve a 100-200 copies par cellules de E. coli!
Si ton plasmide est gros et a bas nombre de copie tu as ta reponse!
Yoyo
Oui en effet ça serait bien se savoir quel plasmide ils ont utilisé! pUC? pGEM-T?
Primum non nocere.
Re : Techniques utilisées en lab de biomol
Salut !
Merci pour les precieux conseils nayeki ...
Sinon le vecteur utilisé est Flag. En fait le truc, c'est qu'on sait pas pourquoi ca marche pas en fait ... On va recommencer la semaine prochaine en faisant des prélévements à chaque étape et les chromatographier afin de voir à partir de quel moment notre ADN s'envole.
Oui QUIAGEN. Pour ce qui est du lavage, je soumettrai cette idée à l'étudiant car c'est fort probable. Notre éthanol est conservé à température ambiante.
Marchi tous !
c'est surement pas par chromatographie que vous allez verifier cela, mais par electrophorese
Sinon de mon point de vue, une bonne lyse bacterienne (tampon P2 a temperature ambiante et pas trop vieux -la soude se perime-)
yoyo
Erf ... surement ! faut dire je recoit pas mal d'information en meme temps depuis que je suis dans le lab :confused:
La soude se périme ! C'est fou ce que j'en apprend tous les jours ...Je note, je note !
Pour la maxi prep, vous êtes parti de bactos congelées déjà transformées, ou alors est-ce que vous avez transformé des bactéries compétentes la veille ?
La seconde chose à considérer, c'est qu'en général, la majorité des manips foirent, ou ne donnent pas le résultat escompté
Salut !
On est parti de bactéries déjà transformées. On ne les a pas transformé pour cette expérience.
Tu les a fait pousser en milieu sélectif ? Normalement c'est pas nécessaire, mais on sait jamais
Si elles commencent à "dater", il se peut que les rendements soient effectivement faibles. De toutes façons, une bactérie "fraichement" transformée est toujours plus productive !Salut !
On est parti de bactéries déjà transformées. On ne les a pas transformé pour cette expérience.
Si elles commencent à "dater", il se peut que les rendements soient effectivement faibles. De toutes façons, une bactérie "fraichement" transformée est toujours plus productive !
A -80 y' a aucun problème
Si ça fait plusieurs années, j'y mettrais pas ma main à couperA -80 y' a aucun problème
J'ai toujours utilisé des vieux stocks d'au moins 3-4 ans, ça marche sans problème
Coucou !
Bonne nouvelle, ma maxipreps d'aujourd'hui à marcher
D'ailleurs pour ce qui est de la transfection, quand on prépare les cultures cellulaires, comment on peut être sur du nombre de cellules que l'on transfecte? J'ai vu qu'on les comptait au microscope et qu'on faisait un calcul avec le volume pour avoir une estimation du nombre de cellules dans le pétri. Mais comment peut on être sur de ce nombre?
Lire attentivement le protocole, preparer son proto sur un papier, identifier le matof et les sauces necessaires, cocher au fur et à mesure sur le papier ce qu'on met ds le tube, déplacer le tube qd on vient de faire qq chose avec... bref etre attentif et concentré...c'est pour cela que les premiers jours dans un vrai lab sont fatiguants!
Bonsoir,
J'ai une petite question sur une technique de labo, moi aussi.
Je vois d'ici les réponses indignées, mais je voudrais être sure...
Sur un gel de polyacrylamide coloré au bleu de Coomassie, est-ce qu'on peut déduire d'une bande à x kDa : "tiens, cette bande à x kDa est présente partout; ça tombe bien, ça veut dire que la protéine Y, qui a justement ce poids moléculaire, est présente dans toutes les conditions."
ça me parait un peu limite, comme interprétation...
Est-ce qu'il peut y avoir plusieurs protéines de (par exemple) 100 kDa? Et si non, quel est le pouvoir de résolution de cette technique?
En fait, j'ai jamais bien compris l'utilité de cette expérience (Coomassie). Quand il manque des bandes dans certains puits, c'est nickel. Mais souvent on n'est pas très sur qu'elles manquent vraiment.... Ou alors on n'est pas sur d'avoir la même quantité de protéines dans tous les puits... Enfin bref, tout ça pour vous dire que j'ai encore jamais résussi un coomassie correct, alors pour les interprétations...
Merci d'avance pour vos réponses
Qu'est-ce que tu essayes de faire ?
Le comassie possède un pouvoir de détection de l'ordre du ng, l'argent est plus efficace (pico) mais le mieux reste un western blot...
D'une manière générale, c'est relativement rare de voir ta prot' en bleu (sauf si tu la surexprimes), et je rajouterais que la quantification des prot' reste un problème majeur aujourd'hui encore... certains y vont même par mass' spec
C'était pour détecter d'éventuelles différences dans les protéines du cerveau entre des souris mutante et WT. Effectivement, on a bien observé toute une région où les bandes étaient plus claires voire absentes (= une famille d'isoformes absents, finalement). mais je me demandais si on pouvait aussi interpréter les bandes qui sont identiques dans les 2 cas...
Il faudrait que je voie quel pourcentage des protéines totales représentent celles auxquelles on s'intéresse...
Sinon, quelqu'un a une idée du pouvoir de résolution d'une électrophorèse + coloration au bleu de coomassie? (deux bandes sont distingables à partir de quelle différence de poids moléculaire?)
ca depends de la concentration de ton gel
En effet deux prot peuvent migrer au meme endroit, mais c'est relativement rare!
Le mieux est d'avoir les anticorps alors il n'y a pas de doute possible.
Yoyo
Hello,
comment êtes-vous certain que c'est votre protéine que vous voyez au bleu (western ?)
Sinon pour la résolution en acrylamide, y'a plusieurs solutions:
Changer le ratio Acryl/ Bis-acryl il est normalement de 39:1 tu peux monter à 175. Attention la polymérisation devient périlleuse, il suffit de faire polymériser à 37 degrés si possible.
Sinon, gel gradient, tu peux les faire toi-même, ou bien les acheter tout-fait.
Enfin, dernière solution les gels 2D, c'est comme ça qu'on fait en protéomique couplé à la mass' spec'
Bon courage
