etude du niveau de phosphorylation d'une protéine en WB

[invite6f8d6648]

Bonjour,
je souhaite étudier l'état de phosphorylation de la protéine FAK, dans des cellules surexprimant une protéine d'intérêt par rapport a des cellules contrôles.
Pour cela je cultive les cellules en puits de FB6 et 3h après l'ensemencement j'effectue un lysat cellulaire directement avec du laemmli 1,5X (par grattage des puits)
Le problème est qu'en western blot j'ai beaucoup de variation d'actine alors que les cellules ont été ensemencées à la mm densité.
Pensez vous qu'il soit nécessaire de réaliser un dosage des protéines afin de déposer précisement la mm quantité de protéines?
Quels sont les meilleures conditions pour l'extraction et pour voir une différence de phosphorylation en western blot?
Est il est nécessaire de dépléter les cellules en serum, la veille de la manip?
merci d'avance pour vos conseils !!!
-----

[invite71f23525]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

Il est toujours mieux de réaliser un dosage de protéines avant un western blot, cela permet d'être bien sûr de ce qu'on dépose.
Pour l'extraction, si tu veux conserver les phosphorylations de ta protéine, il faut de l'orthovanadate de sodium (inhibiteur de phosphatase) dans le tampon et éventuellement d'autres inhibiteurs. Mais surtout garder les échantillons dans la glace le plus possible une fois l'extraction faite, cela limite d'autant plus les déphosphorylations.
Si l'actine varie beaucoup, cela peut provenir de tes conditions expérimentales. Je ne connais pas ton sujet mais si tu travailles sur la Focal Adhesion Kinase, peut-être il y a un lien avec la plasticité du cytosquelette d'actine et donc l'expression de l'actine. Essayes un autre témoin de dépôt comme Hsp60, la GAPDH ou la beta-tubuline pour n'en citer que quelques-uns.

Greg

[invite6f8d6648]

merci pour tes conseils !!!
je vais essayer une technique d'extraction avec des inhibiteurs, j'ai trouvé un protocole qui me semble adapté, et j'effectuerai un dosage avant de déposer.
C'est vrai que l'actine ne semble pas être un si bon contrôle de dépôt si je regarde la focal adhesion kinase, je n'avais pas pensé à cela.
Merci encore !