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Courbes PCR en temps réel



  1. #1
    mimita20

    Courbes PCR en temps réel


    ------

    Bonsoir les amis,
    J'ai un article à exposer concernant la PCR en temps réel, et j'ai pas pu comprendre les courbes resultantes, si quelq'un peut m'aider à les commenter, ou juste des idées pour m'avancer
    ET merci d'avance

    -----
    Fichiers attachés Fichiers attachés
    Je me fie quasi jamais aux premières pensées qui me viennent....

  2. #2
    Flyingbike

    Re : Courbes PCR en temps réel

    Alors petit rappel : le principe de la PCR quantitative est qu'on est capable de suivre l'évolution de la quantité d'amplicon formée au fil des cycles. Pour cela, on a une matrice, une paire d'amorces ciblant la région que l'on veut amplifier, une enzyme, des nucléotides, et un colorant fluorescent de l'ADN.
    Ce colorant a la particularité de devenir fluorescent lorsqu'il est intercalé dans l'ADN.
    A chaque cycle d'amplification, dans la théorie, la quantité d'amplicon double.

    Cette PCR est dite quantitative, puisque vu qu'on est capables de savoir a tout moment combien on a synthétisé d'ADN dans le tube, on peut déterminer la quantité initiale de matrice. Cette quantité initiale est déterminée a partir du nombre de cycle nécessaire a ce que l'intensité de fluorescence atteigne un certain seuil.

    Ainsi, plus la courbe "décolle" tot, plus il y a de ta séquence d'intéret. Par exemple en A et en B.

    Pour s'assurer de la spécificité de l'amplification, on réalise a la fin des cycles d'amplification une rampe de température qui permet de déterminer le point de fusion des produits formés. Pour cela, on fait passer la température de 55 à 85° par petits intervalles tout en mesurant la fluorescence. Comme la fluorescence disparait quand l'ADN est dénaturé, lorsque l'on atteint la température de fusion de notre produit, il ya une grosse chute de l'intensité de fluorescence. On représente ça sous forme de vitesse de disparition de la fluorescence en fonction de la température, comme en C ou D.

    Cela permet de s'assurer que le produit de PCR est unique et donc que la PCR est spécifique. En C par exemple, le produit majoritaire a un Tm de 72°.

    Il y en aurait énormément plus a dire, mais je préfère que tu me dises si ma réponse te convient et si tu veux des éclaircissements a certains endroits.

  3. #3
    mimita20

    Re : Courbes PCR en temps réel

    Bonsoir,
    Au fait, je viens de lire de ton message un peu en retard car j'ai passé mon exposé cette aprémidi, n'empeche que pour la courbe de fusion, j'ai pas dit tout ce detail, enfin juste que que le fai que tous les échantillons presentent le meme pic de température donc c'est bien le gène recherché avec quelques définitions, de courbe de fusion et Tm, pour le premier graphe je l'ai analysé de la même manière que toi avec plus de détail.
    En tous cas merci pour tes eclaircissement, ça m'aidera tôt ou tard :d
    Je me fie quasi jamais aux premières pensées qui me viennent....

  4. #4
    Flyingbike

    Re : Courbes PCR en temps réel

    au plaisir !

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