enzyme de restriction
Bonjour,
J'ai un problème avec une digestion d'ADN amplifiés par PCR par l'enzyme de restriction Mnl1, une bande supplémentaire que je n'attendais pas apparaît, alors que ma PCR est spécifique et n'est pas contaminée. Mes réactifs de digestion non plus ne sont pas contaminés, j'ai vérifié avec le blanc de PCR. Cette enzyme n'a pas d'effet star, et fonctionne de façon assez classique. Avez-vous une idée ?
merci d'avance
Si une bande supplémentaire apparait c'est qu'il existe un site de restriction dans votre amplicon. Je vois deux possibilités:
La première, la séquence que vous attendez n'est pas la vraie séquence génétique. Les banques de données ne sont pas exempts d'erreurs.
Il existe une site de restriction cryptique dans votre séquence. Il n'est pas absolument le site de restriction mais est pourtant reconnu par l'enzyme. Ce serait quand même étonnant que l'efficacité de coupure soit grande.
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
merci de votre réponse.
Effectivement, j'ai regardé un possible site cryptique, mais la séquence concernée est l'exon 20 du gène CFTR, et qui est très étudiée, et je n'ai rien trouvé dans la littérature à ce sujet...
Tu as peut-être utilisé l'enzyme dans des conditions imparfaites (erreurs de proportions, de temps ou de durées d'incubation). Pour certaines enzymes au moins, cela entraîne des problèmes de spécificité si bien que l'enzyme reconnait et clive d'autres sites. On parle d'activité STAREnvoyé par orion95
Cet effet Star n'est pas connu pour l'enzyme Mnl1, mais j'ai constaté que le fournisseur avait récemment changé de tampon de réaction pour cette enzyme, et moi j'ai utilisé l'ancien, ça a peut-être un lien ...en tout cas, merci de vos réponses !
