Clonage dans plasmide

[invitea80f9f29]

Bonjour,

Je suis en première année de pharmacie et nouvelle sur ce forum!!

Je voudrais savoir si un géne inséré dans un plasmide s'exprime toujours une fois le plasmide introduit dans ne cellule comme E.coli?
Si ce n'est pas le cas, est-ce que ceci est du au fait que certains génes ne sont actifs que si leurs sites de regulation sont occupés? Si ces sites de regulation ne sont pas également intégrés dans le plasmide, le géne ne s'exprimera pas dans la cellule hôte?

Si quelsu'un peut me dire si je raconte des bêtises ou pas ... !!


Merci d'avance!
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[LXR]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

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LXR pour la modération

[invitea80f9f29]

d'accord! mais je ne savais pas comment créer une nouvelle discussion, enfin je n'ai pas trop cherché non plus...!!!

[invitedd15fcb5]

Bonjour,
alors généralement si l'insertion de ton plasmide dans la cellule a fonctionné, le gêne est exprimé.
Il n'est pas nécessaire d'introduire dans le plasmide les sites de régulations spécifiques au gêne, car le plasmide (sans le gêne d'intérêt)peut déjà contenir divers éléments dont un promoteur et parfois d'autres éléments régulateurs, cela dépend de l'utilité que tu en as.

J'espère avoir répondu à ta question

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea80f9f29]

Bonjour,

Donc j'ai bien la réponse à ma question! Merci!
Mais du coup je ne sais pas quoi répondre à un exercice...!

On me dit qu'un chercheur a isolé une petite quantité d'une certaine enzyme. Il a ensuite obtenu un clone génomique complet du géne codant l'enzyme, puis il le lia à un promoteur bactérien fort sur un plasmide. Une fois le plasmide introduit dans E.coli, il constata qu'aucune enzyme n'était produite...
On doit donc trouver une explication à cet échec.

J'avais donc pensé aux différents facteurs de régulation des génes eucaryotes!
Est-ce qu'on peut dire que le géne n'a pas été inseré dans le plasmide (ou mal inseré)...?

[invitedd15fcb5]

Il se peut en effet que ton gène soit mal inséré dans le plasmide ou pas du tout. De même si le plasmide qui est dans la bactérie n'est pas sous forme circulaire mais linéaire (à cause par exemple d'un mauvais choix d'enzymes de restriction lors de l'insertion du gène) il ne sera pas transcrit par la bactérie.

[invitea80f9f29]

D'accord, merci beaucoup!
Du coup pour savoir si le gène est bien inséré ou non, on peut utiliser la méthode de l'alpha-complémentation.
Sinon pourquoi un plasmide linéaire ne sera jamais transcrit par la cellule? Est-ce que c'est lié à l'origine de replication du plasmide?

[invitedd15fcb5]

Je ne peux pas te répondre avec exactitude, mais je pense que comme le chromosome de E. Coli (ainsi que la majorité des bactéries) est circulaire, l'introduction d'un brin d'ADN linéaire sera considéré comme de l'ADN endommagé et donc non transcrit et non répliqué.

Je ne pas sur du tout de cela donc si quelqu'un peut confirmer...

[piwi]

Elle vient d'où cette enzyme? D'un eucaryote?
Je tique parce que l'on parle d'un clone génomique. Le fait d'introduire cette précision me fait penser qu'elle est utile. Chez les eucaryotes vous avez des introns qui n'existent pas dans les gènes de E.Coli. Si vous introduisez une telle séquence génomique dans cette bactérie, elle ne fera pas l'excision des introns. Vous allez donc traduire les introns et il y a fort à parier que (1) vous allez y trouver un STOP ou (2) que même si l'intron est court vous risquez de décaller la phase de lecture et de faire apparaitre un STOP.

Ca me semble correspondre beaucoup mieux aux types de réponses attendues à un exo que les suppositions faites plus haut; sous réserve que la séquence insérée soit bien une séquence eucaryote.

Cordialement,
piwi

[invitea80f9f29]

Oui en effet il est précisé que c'est une enzyme humaine. Je n'avais pas pensé aux introns qu'Ecoli n'excise pas...! Merci beaucoup!
Mais l'hypothése du géne mal inséré peut toujours être possible?

[piwi]

En général, les exercices se font sous l'hypothèse que ce qui est décrit a été réalisé correctement. Sinon, on peut supposer n'importe quoi.
Si on vous dit que le chercheur a cloné la séquence sous le contrôle d'un promoteur fort, c'est qu'il l'a fait dans de bonnes conditions (en respectant la phase par exemple).
Non là, avec ce que vous me dites, le problème est très clairement ce que je vous disais plus haut. N'allez pas chercher plus loin.

Cordialement,
piwi

[Flyingbike]

il ya des milliers d'explications dont l'histoire de l'insertion, mais je pense que le but de la question et de répondre comme l'a très bien fait piwi. Une séquence génomique n'a aucune chance de s'exprimer dans E. Coli a cause des introns. C'est pour cela que dans ce cas, on utilise un cDNA obtenu a partir de l'ARNm mature.

[invitea80f9f29]

Merci beaucoup à vous 3 pour vos réponses, vous m'avez bien éclairée!!