Méthodes de purification du lysozyme

[YeGhos]

Bonjour,

J'ai effectué un TP sur la purification du lysozyme par colonne échangeuse de cation (CM52).
Avec le calcul de l'activité enzymatique j'ai un enrichissement de 16 pour un rendement de 32%. Je trouve que ma purification demande un sacrifice trop important pour un si petit résultat. Dans la partie discution de mon rapport je voudrais dire qu'une autre méthode aurait pu me permettre d'avoir un meilleur taux de purification avec un meilleur rendement, mais voilà, je n'en trouve pas sur internet concernant spécifiquement les protéines.
Dans (1) J.M. Berg, J.L. Tymoczko, L.Stryer, BIOCHIMIE 6e édition, 2008(Paris)Médecine- sciences Flammarion, j'avais trouvé une succession de méthodes qui permettait d'obtenir un enrichissement de 3000 avec un rendement de 30%!! (magnifique n'est ce pas), malheureusement la bibliothèque est fermée et je n'ai pas pensé à noter tout ça et mon rapport doit être imprimé ce soir hum... merci d'avance.
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[Anetheron]

Bonsoir,

Tu peux déjà jouer sur tes paramètres de chromatographie pour améliorer ces chiffres (taille de la colonne, conditions d'élution... par exemple jouer sur le pH a plus de risques de dégrader un certain pourcentage de ton enzyme, donc de diminuer ton enrichissement, qu'en éluant en augmentant la force ionique du tampon).

Si tu disposes d'anticorps spécifiques (ce qui est le cas pour le lysosyme je suppose), tu peux faire une chromatographie d'immunoaffinité (les groupements chargés négativement de ta résine sont remplacés par des anticorps spécifiques de ta protéine). tu peux trouver des protocoles sur internet, en utilisant ce terme ou bien "immunocapture".
Les deux inconvénients majeurs sont que les conditions d'élution de ta protéines peuvent la dégrader, et surtout que ça coûte très cher comparé à la colonne échangeuse d'ions. Je n'ai malheureusement pas de chiffres à donner sur l'enrichissement et le rendement de ce genre de méthodes.

[YeGhos]

Super merci beaucoup pour cette réponse très rapide et satisfaisante.
Je précise juste que l'on a utilisé une méthode par compétition dans la colonne et non pas de variation de pH car le pHi du lysozyme est de 11!! Et si l'on met un pH plus élevé on aurait effectivement eu une dénaturation de la protéine.

Sinon au niveau des chiffres ce n'est pas un soucis j'insiste suffisamment dans mon rapport sur le fait que l'enrichissement et le rendement dépendent de la nature de la protéine et de la méthode de purification.

Merci beaucoup.