Design primers pour PCR sur cDNA

[invite36840f10]

Bonjour,
je suis actuellement en stage de fin d'études, et je travaille sur des gènes de soja. J'ai des gènes potentiellement impliqués dans la synthèse d'une substance (3 candidats, qui ont des séquences très similaires). Je souhaite vérifier leur expression dans plusieurs organes de la plante, à différents stades.
Pour cela, j'ai prévu de réaliser des extractions d'ARN (avec un kit Qiagen) sur ces organes, à ces stades donnés. Puis une RT (là encore, avec un kit, de chez Applied Biosystems), avec des random primers.
Ensuite, je prévois de faire des PCR sur les cDNA obtenus. Pour ces PCR, j'ai designé des amorces spécifiques, sur les régions UTR et au niveau des jonctions exon/exon. En fait je souhaiterais être sûre que ces amorces conviendront, avant de les commander. N'ayant jamais fait cette manip ce n'est pas très très clair dans ma tête, donc je vais essayer de simplifier autant que possible.
Ma question étant, logiquement un cDNA c'est simple brin, est-ce que ça change quelque chose au niveau des amorces? Ou dois-je toujours faire une forward correspondant à la séquence du cDNA et une reverse complémentaire de la séquence du cDNA?

Merci d'avance.
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[invite71f23525]

Bonjour et bienvenue sur Futura Sciences,

C'est une PCR classique, donc oui il faut un forward et un reverse. La différence de la qPCR avec une PCR sur une matrice double brin, c'est qu'au cours du premier cycle, seul le brin reverse sera synthétisé. A partir du deuxième cycle, on est donc en présence d'ADN double brin, donc identique à la PCR "classique".

Pour le design de primers, pense à blaster tes primers afin de t'assurer qu'ils ne croisent pas avec autre chose. La taille des amplicons générés doit se situer entre 100 et 200 bases en général.

Sinon il y a un tas de petits programmes qui te permettent de designer tes primers. L'un des plus connus est ePrimer qui est devenu Primer-Blast : c'est une version évoluée d'ePrimer qui te designe et te blaste tes primers dans la foulée.

[invite36840f10]

OK merci pour votre réponse si rapide, je ne fais donc pas de changement au niveau de la méthode de design. J'utilise le logiciel Primer3 car c'est le premier dont on m'a parlé, je le maitrise bien à présent donc je souhaite continuer avec celui-là, il est très simple d'utilisation.
J'avais effectivement oublié de blaster mes amorces (d'habitude j'y pense -_-) donc je vais le faire dès à présent.
Par contre, les amplicons prévus avec les amorces que j'ai designées sont entre 500 et 1000 pb, et pas entre 100 et 200. Il s'agit en effet de "gros" gènes (3500 à 3900 pb) et le pourcentage en GC est assez faible, il m'est donc difficile d'en designer d'autres.
J'ai bien conscience que plus l'amplicon est petit, plus il est facile à obtenir, mais j'ai déjà dû amplifier les gènes en entier (en faisant varier le MG et en ajoutant du DMSO) donc je m'étais dit que 800pb, ça devrait passer...

[invite36840f10]

Je viens de comprendre toute seule le risque d'avoir de si gros amplicons...
Vu que j'utilise des random primers pour la RT, rien ne me garantit que j'aie les cDNA "en entier", et donc si ce n'est pas le cas je me retrouve toute bête car mes amorces ne pourront rien amplifier...

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite853321bf]

Les amorces sont l'un des rares "ingrédients" en biologie moléculaire peu chers donc la perte en coup est minime, le plus gros problème que tu peux rencontrer est le temps, étant en stage, cette ressource reste assez limitée.
On peut faire des PCR classiques et même temps réel sur des amplicons plus grand que 100-200 pb, le problème sera le temps de manip plus long, donc le plus grand risque de mésappariement, etc.
Je fais une temps réel avec un amplicon de 750pb, ça passe très bien.

[invite9a3c2e6a]

Salut, je veux lancer une PCR pour amplifier un fragment d'env 400 bp. (avec du M13) Est-ce trop long? quels sont les risques à craindre? C'est pour faire ensuite du séquençage. Je ferai ma visualisation à l'aide d'un Multina (http://www.shimadzu.com/an/lifescien.../multina2.html). Merci bien. Je suis nouveau et donc excusez si je m'immisce dans un forum qui parlait (un peu) d'autre chose...

[TanguyE]

Bonjour,

En général, c'est plus efficace de créer sa propre discussion

400bp pour une PCR classique c'est rien du tout. Si tu veux être sûr de ton produit de PCR pour pouvoir le séquencer, utilise une Taq haute fidélité histoire de limiter les erreurs de réplication.