Séparation en gradient sucrose

[invitea175c768]

bonjour à tous
je cherche à démontrer la présence d'une protéine transmembranaire dans des microdomaines lipidiques résistants aux détergents (type Raft) par ultracentrifugation sur gradient sucrose 5%-40%. Malheureusement, cette protéine a également la propriété de former des supracomplexes de très haut Poids moléculaure qui sédimentent également dans des fractions sucrose de faible densité sur ce même type de gradient. Comment puis je faire la différence et affirmer que la position de la protéine dans le gradient est dépendante de sa localisation dans les Rafts et non de son degré de polymérisation ?
Merci pour votre aide.
Vav
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[gorben]

Tu as essaye de faire ton gradient en presence de haute concentration de detergeant? Vu que tu sais que ca ne change en rien sa localisation dans les Rafts, ca pourrait empecher la formation de complexes.
Sinon peut etre peux tu detecter la presence de lipide dans ta fraction de la proteine?

A+

[invite71f23525]

En complément de l'idée de Gorben qui suggère de regarder la présence de lipides dans la fraction que tu prélèves (si possible les lipides enrichis dans les rafts comme cholestérol et sphingomyéline), je dirais que tu peux faire un western blot sur la fraction avec un anticorps dirigé contre ta protéine, et un anticorps dirigé contre un marqueur des rafts (la flotiline il me semble). C'est la procédure couramment utilisé lors d'expérience de fractionnement subcellulaire : on vérifie la présence de marqueurs spécifiques du compartiment isolé. Comme marqueur négatif, tu peux essayer de voir s'il existe des protéines membranaires dont on est sûr qu'elles ne localisent pas dans les rafts. Le mieux est de consulter des publications qui ont traité ce genre de problème afin de voir les marqueurs utilisés.

Ensuite, pour confirmer cette approche, tu peux faire un marquage fluo de ta protéine et d'une protéine localisée dans les rafts et regarder leur colocalisation en immunofluorescence (je dirais même que c'est indispensable).

[invitea175c768]

merci a vous 2 pour vos conseils
Pour répondre à Gorben, je fais les gradients en 0,1% triton. Je crains de disperser les rafts en travaillant à plus forte concentration car selon leur composition lipidique, certaines catégories de rafts peuvent y etre sensibles.
J'ai envisagé aussi d'analyser la composition lipidique des fractions mais à nouveau je rencontre un probleme. La protéine étant située sur la Mb interne mitochondriale, les DRM qu'on y trouve ont une composition lipidique très particulière et se distinguent surtout par leur richesse en cardiolipine. Or celle ci est difficile à quantifier par HPTLC car elle est masquée par un autre phospholipide. D'autre part, contrairement aux rafts classiques, ces DRM Mito sont très pauvres en cholestérol donc les traitements types MßCD fumonisine etc... sont inefficaces pour provoquer leur dispersion in vivo (sur cellules) ! Une façon de résoudre en partie ce probleme serait de trouver un moyen de dépléter les cellules en cardioLipine mais je ne vois pas comment faire celà....Si vous avez des idées....
Pour ce qui est des marqueurs protéiques, le probleme est presque le même : les marqueurs de rafts traditionnels type Cav1, flotilline, reggies... ne sont pas exprimés dans ces DRM.
Bref, je suis un peu coincée....
Merci pour vos conseils et j'espere à bientot
VAV

[A voir en vidéo sur Futura]

[gorben]

Je pensais, pourquoi ne pas fixer tes rafts avec du formaldehyde avant de deposer sur un gradient de sucrose? Ensuite vu que tes rafts seront fixes, rien ne t'empeche de charger en detergeants/denaturants pour empecher la formation de supracomplexe.

Sinon, pourquoi ne pas faire une extraction specifique de la membrane? Je ne sais pas si ca se fait chez les mitochondries, mais en tous cas chez les bacteries c'est pas difficile et ca donne de bons resultats.

A+

[invite71f23525]

Je pensais, pourquoi ne pas fixer tes rafts avec du formaldehyde avant de deposer sur un gradient de sucrose? Ensuite vu que tes rafts seront fixes, rien ne t'empeche de charger en detergeants/denaturants pour empecher la formation de supracomplexe.

L'idée pourrait être bonne si les lipides pouvaient être fixés par le formaldehyde, ce qui n'est pas le cas. Il y a tout de même les protéines autour de la membrane qui en étant fixées permettent le maintien de la structure membranaire, mais les lipides ne sont pas fixés pour autant. Et le problème subsistant serait de pouvoir se débarrasser du formaldehyde après la récupération de la fraction pour pouvoir l'analyser.

Sinon, pourquoi ne pas faire une extraction specifique de la membrane? Je ne sais pas si ca se fait chez les mitochondries, mais en tous cas chez les bacteries c'est pas difficile et ca donne de bons resultats.

A+

En effet c'est une bonne idée, des protocoles existent même pour isoler la membrane interne et la membrane externe mitochondriale. Cependant il ne faut pas être en quantité limitante de cellules, car le rendement est très faible.

Autre chose : la microscopie à transmission avec marquage immunogold de ta protéine. Ainsi tu as accès à l'ultrastructure de la mitochondrie, normalement les rafts sont visibles en microscopie à transmission, mais pour les rafts mitochondriaux je ne sais pas. Le marquage immunogold te permet ainsi de voir très précisément où localise ta protéine.

[invitea175c768]

bonjour à tous les 2
echange riche d'info. Effectivement , l'approche formaldéhyde ne me parait pas adaptée.
Je connais également les techniques permettant de séparer mb externe et interne Mitochondriale mais elles ne permettent pas d'isoler spécifiquement les radeaux. A priori ma protéine serait sur la mb interne mais je n'exclue pas sa possible relocalisation sur la mb externe dans certaines régions spécialisées. Par contre, si gorben connait des protocoles permettant d'isoler les rafts bactériens, ca m'interesse. De plus, connait il la composition lipidique de la Mb bactérienne pour que je puisse regarder si elle ressemble à celle de la mb interne mitochondriale
Merci beaucoup de votre aide à tous les 2, même si je n'ai pas encore la solution, je progresse !!!
A+
Vav