séparation de protéines

[inviteb917ca52]

bonjour à tous

tout d'abord je suis nouvelle sur le forum, j'ai enfin passer le cap de l'inscription
merci à toute la communauté, car je vous lis depuis pas mal de temps et vos conversation sont une mine d'infos....

alors voilà mon problème: nous avons un mélange de protéine (on sait pas trop leurs poids) que nous voulons séparer et caractériser par la suite. Actuellement je fais des SDS-PAGE (15%), mes échantillons sont des fraction issus d'une chromato échangeuse d'ion. La qualité des gels est pas top, en effet les bandes sont assez épaisses et étalées. Je pense que ça vient d'une forte concentration ou pas... comment affiner la résolution ou encore le pouvoir de séparation...
j'ai également fait une MS/MS sur ces mêmes échantillons et trouve des poids du genre 20kDa, 40kDa, 82kDa... je pense qu'il y formation de dimère lors de la migration, ou on a vraiment des protéine de ce poids... comment en être sur?
quel agent utiliser (autre que le béta-mercapto) pour être sur d'avoir une structure linéaire et qu'il n'y est aucun problème polymérisation des protéine lors de la migration....

merci par avance pour votre aide
bon week end à tous
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[Yoyo]

salut

Il te faut du SDS, si ton gel est en condition dénaturante, il est peu probable que tu aies des dimeres.
Si tes bandes sont trop épaisses, c'est que tu as déposé trop de protéines sur ton gel (quel % les gels?).
tu révèles comment tes protéines?

YOyo

[invite28f6e6c6]

Pour ne plus avoir de structure 3D, il faut un detergent (SDS ou autres) et un agent chaotropique (chaleur ou urée).
Plus tu as de sels, plus tu auras de probleme de migration.
Tes echantillons devraient être dialysé puis repris dans le tampon de dépot et chauffé 5/10min à 95°C.
Ensuite tu peux faire ta migration.
Si tu veux retirer les ponts disulfure, tu utilise soit du b-mercapto soit du DTT.

[Aqualung]

J'ai parfois eu la formation de dimère si je n'ajoutais pas de beta-mercaptoethanol (ou du DTT)

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite28f6e6c6]

D’après la définition consacrée, deux chaines polypeptidique lié par un pont disulfure sont un monomère. Les dimères sont quasiment tous détruits en electro dénaturante.