Clonage sh dans un plasmide

[invitee6ff25aa]

Bonjour,

Je souhaiterais cloner un sh dans un plasmide contenant une construction mir30 based dans laquelle je peux cloner n'importe quel sh en coupant par Xho1 et EcoR1.

J'ai donc commander mes 2 oligos, je les annheale, et je les clone dans le plasmide coupé au préalable par Ecor1 et Xho1. Mes oligos ont été commandés avec en 5' et 3' les sites déjà digérés.

Après transfo de mon produit de digestion je n'ai aucun clone.

Je me demandais si je n'aurais pas mieux fait de commander les oligos avec le site de restriction suivi de quelques bases afin d'annhealer puis couper par mes enzymes? Est ce que effectivement mon problème peut venir de là??

Qu'en pensez-vous?

J'espère que c'est clair... Et merci pour votre aide.

Flabelg
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[invite30157012]

Bonjour,
Moi je fais comme tu le décris avec les sites compatibles en 5' et 3' de mes oligos. Tu veux dire transformation du produit de ligation? Tu fais une ligation de ton plasmide et tes oligos hybridés? Quel rapport tu utilises?
Ce qui est bizarre c'est que même si tu n'as pas cloné ton oligo tu devrais avoir un bruit de fond avec quelques clones de vecteurs non digéré... Aucuns clones ça veut peut-être dire qu'il y a un problème de transfo...
Tu peux aussi faire migrer ton produit de ligation sur gel pour voir si tu as bien du plasmide circulaire ligué...
Bon courgae