Expression anormale d'une protéine exogène

[invitea74316c7]

Bonjour,
Dans le cadre de mon travail de thèse j'utilise des cellules HEK que je transfecte avec un cDNA codant pour un canal. Il se trouve que ce canal doit naturellement se placer à la membrane plasmique. Les cellules que j'avais au début exprimait le plasmide au niveau de la membrane puis après quelque temps la protéine n'était exprimée que dans le cytoplasme. Nous avons ensuite pris un nouveau stock de HEK qui ont fait exactement la même chose. a savoir qu'au départ l'expression était correcte puis la protéine s'est retrouvée bloqué dans le cytoplasme. Comment peut on expliquer ce type de changement dans l'expression et surtout que faire?
Je transfecte mes cellules par calcium-phosphate.
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[invitef5962f47]

Tu fais une transfection stable ou transitoire ? Toute ta population de cellules est touchée par ce phénomène ou seulement une partie ? Toutes les protéines se retrouvent dans le cytoplasme ou une partie d'entre elles migrent quand même au niveau membranaire ?

Enfin dans tous les cas, les cellules HEK accumulent des mutations/translocations/etc au fur et a mesure de leurs réplications, ça a peut être une influence.

[invite71f23525]

Tu peux essayer de changer l'agent de transfection. En effet, c'est peut être l'agent de transfection qui perturbe l'intégrité membranaire et empêche la protéine d'y localiser. Essayes de transfecter avec du PEI ou avec des liposomes cationiques (lipofectine, lipofectamine, fugene,.....) ça changera peut-être quelque chose. Tu as essayé un autre type cellulaire, les Cos par exemple? La préparation de plasmide que tu utilises date-t-elle?

[inviteaefe4c90]

Bonjour à tous(tes),

D'accord avec les suggestions précédentes, mis à part les erreurs systématiques, peut-être il y a tout simplement une internalisation de ton récepteur?

CDLT

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitea74316c7]

Hello, merci de vos réponses.
Alors il s'agit d'une transition transitoire au calcium phosphate. A première vue il semblerait qu'une petite partie se trouve à la membrane mais vraiment très très peu.

Je suis en train d'essayer de faire la même expérience avec des Hela. Ma préparation de plasmide à environ 1 ans mais je fais naturellement des aliquots et mon stock courant n'est pas congelé mais conservé à 4°C. Concernant l'agent de transfection cela n'explique pas pourquoi lors de mes premières expériences je me suis trouvé avec une expression correcte de la protéine et pas par la suite.

Concernant l'internalisation du canal j'en doute sachant que j'ai toujours travaillé avec les même temps et actuellement sur immuno on voit clairement que le canal est cytoplasmique mais il n'apparait pas sous forme de point faisant penser qu'il est internalisé pour dégradation.

Le fait d'avoir eu mes cellules en hyperconfluence lors de certains passage a t'il pu avoir une conséquence?

[invitea74316c7]

Une contamination forte au mycoplasme peut elle causer de tel changement? Je sais, de source sur, que nos cellules sont contaminées par les mycoplasmes. Du coups il est possible que lors des premiers passage les mycoplasme soit relativement peu présent avant d'augmenter et finalement de modifier la membrane cellulaire!

[invite71f23525]

Une contamination forte au mycoplasme peut elle causer de tel changement? Je sais, de source sur, que nos cellules sont contaminées par les mycoplasmes. Du coups il est possible que lors des premiers passage les mycoplasme soit relativement peu présent avant d'augmenter et finalement de modifier la membrane cellulaire!

Je ne comprends pas bien comment on peut travailler avec des mycoplasmes. Les résultats obtenus sont de toute façon impossibles à interpréter puisque dans ce cas on n'est pas en situation normale, on est en situation infecté par des mycoplasmes. Je commencerais déjà par me procurer des cellules exemptes de mycoplasmes, et c'est ensuite que j'attaquerais les manips. J'ai déjà pu voir des exemples malheureux de personnes travaillant avec des mycoplasmes en le sachant pertinemment, les résultats obtenus sont forcément biaisés.... Cellules mycoplasmées = cellules à jeter.

[invitea74316c7]

Oui je suis pleinement d'accord avec toi!! Malheureusement j'en suis bien conscient mais les différents responsables de mon département ne sont pas pour les changer! Je vais m'en fournir d'ailleurs et en meilleur forme puis les conserver séparées!

[invitec0b62935]

Oui je suis pleinement d'accord avec toi!! Malheureusement j'en suis bien conscient mais les différents responsables de mon département ne sont pas pour les changer! Je vais m'en fournir d'ailleurs et en meilleur forme puis les conserver séparées!

Si les mycoplasmes ont trouve l´entree de ton laboratoire, tu ne vas pas t´en debarasser comme ca simplement en partant d´un autre stock.
Essaie de repartir d´un autre stock mais si celui-ci est aussi contamine, c´est probablement ton labo dans son ensemble qui est contamine et les solutions pour s´en debarasser ne sont pas simples.

[invitea74316c7]

Je me suis mal exprimé, quand je dis que je vais m'en fournir d'autre je parle d'en commander à l'ATCC. Ensuite je vais devoir les conserver à -80°C car sauf erreur les mycoplasmes se transmettent également par l'azote liquide.

[invite1f0474b9]

On a aussi eu une contamination. Mais avec de l´acharnement vous pouvez vous en débarrasser.

Il existe de bon kit pour les détecter et aussi un bon kit pour les éliminer. La solution c´est de fragmenter les places de travail, les incubateurs, jetté les cellules irrécupérables.

[invite4ff72fd5]

Est ce que la surex de ton canal au niveau de la membrane n'est pas mauvais pour tes cellules et que tu sélectionne dans ta culture celles qui perdent l'adressage à la membrane?

Tes changements apparaissent au bout de cb de temps?