Plasmide eucaryote/bactérien dans une lignée cellulaire

[invitef5962f47]

Bonsoir,

Alors j'ai deux petites questions sur l'utilisation de plasmides dans une lignée cellulaire.

Un gene eucaryote (avec son promoteur naturel) cloné dans un vecteur bactérien sera t'il exprimé dans une cellule humaine ?

Lors d'une transformation transitoire, est ce que les histones se lient a l'ADN du vecteur pour former des nucléosomes ou la petite taille du plasmide empêche justement les nucléosomes de se former ? Observera-t'on une différence entre un plasmide eucaryote et un plasmide bactérien au niveau de ces nucléosomes?

Merci d'avance.
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[invite0d608256]

La plupart des plasmides que l'on trouve dans les labo sont des plasmides navettes qui sont à la fois capable de se maintenir dans une bactérie ou un dans un organisme eucaryote.
Il existe des plasmide strictement bactérien mais ils n'ont pas les séquences qui leur permettent de se maintenir dans des cellules eucaryotes...
Je ne connais aucun plasmide strictement eucaryote car la phase bactérie sert à amplifier le plasmide.

Pour ton gène eucaryote tout va dépendre de quel organisme ça vient.
Un gène humain avec son propre promoteur dans de l'humain ça marche.
Un gène de levure avec son propre promoteur dans de l'humain ça marche pas
Tous les promoteurs eucaryotes ne sont pas identiques certains fonctionne chez d'autres espèces (en général ce sont des gènes issus d'organismes pathogènes) mais selon mon expérience la plupart du temps ça ne marche pas. C'est pourquoi on utilise des plasmide dit d'expression qui ont un promoteur et un terminateur plus ou moins fort en fonction de ce que tu veux faire voir même inductible, provenant en général de l'organisme hôte.

[invitef5962f47]

Il existe des plasmide strictement bactérien mais ils n'ont pas les séquences qui leur permettent de se maintenir dans des cellules eucaryotes...

Justement, est-ce important pour une transformation transitoire (en gros 24h) ?

Sinon c'est un gène humain, je sais que le promoteur naturel est assez fort mais quand je transforme une lignée cellulaire avec un plasmide bactérien (donc sans origine de réplication eucaryote) contenant ce gène je n'observe aucune expression. Je cherche donc a savoir si le problème vient du vecteur bactérien ou non avant de me lancer dans le clonage du gène dans un vecteur eucaryote.

[invitec9f0f895]

Salut

Normalement en transfection transitoire pendant 24h ca ne pose pas de probleme.
Il est cependant possible que 24h ne soit pas suffisant pour observer ta protéine, tu pourrais peut etre ralonger un peu le temps d'expression?

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite0d608256]

Le soucis si on veut exprimer plus longtemps va être la sélection des transformants.
Dans ta population de cellules après transfo seulement une partie a pris le plasmide. Si tu n'as pas de marqueur sur ce plasmide pour le sélectionner tu ne sauras pas si ta transfo a marché mal/bien/très bien et donc l'efficacité de ta transfo.
Sur beaucoup de plasmide si tu ne maintient pas de pression de sélection le plasmide est perdu très rapidement et au final tu vas regarder des cellules sans plasmide...

[invite30157012]

Pas besoin de sélectionner si c'est du transitoire, en revanche il faut s'assurer que les meilleures conditions ont été choisies pour voir une expression, tu transfectes les cellules? auquel cas, il faut tester plusieurs conditions de transfections, différentes quantités de vecteurs avec différentes quantités en excès de lipofectamine ou autre transfectant, car tu es peut-être dans des conditions ou tu ne transfectes pas beaucoup, puis tester l'expression à 24h et 48h post-transfection comme l'a proposé Yoyo.

[invitef5962f47]

Pas besoin de sélectionner si c'est du transitoire, en revanche il faut s'assurer que les meilleures conditions ont été choisies pour voir une expression, tu transfectes les cellules? auquel cas, il faut tester plusieurs conditions de transfections, différentes quantités de vecteurs avec différentes quantités en excès de lipofectamine ou autre transfectant, car tu es peut-être dans des conditions ou tu ne transfectes pas beaucoup, puis tester l'expression à 24h et 48h post-transfection comme l'a proposé Yoyo.

J'utilise des HEK-293 et mes conditions de transformations pour cette souche sont optimales (~ 90% de cellules transformées). J'ai déjà transformée cette lignée avec d'autres plasmides qui ont bien exprimés leur gène donc je doute que ça soit la transformation qui pose problème.
Sinon je vais tester 48h d'expression pour voir si j'observe une différence.

Merci de vos réponses.