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même marquage immunofluorescence dans le vert et le rouge



  1. #1
    imenely

    Exclamation même marquage immunofluorescence dans le vert et le rouge

    Bonjour,

    J'ai réalisé un double marquage immunofluorescent, protéine d'intérêt et protéine mitochondriale et le marquage sort exactement le même, dans un premier temps j'ai pensé que ma protéine se localisait exclusivement dans la mitochondrie. Mais voilà, en marquant la même protéine et une autre protéine non mitochondriale cette fois-ci, le marquage est complètement diffus et les deux marquages se superposent. J'ai pensé que je m'étais trompé dans mes anticorps secondaires mais après vérification, il s'avère que non! donc je ne comprends pas d'où ça peut venir. Je précise que là j'ai utilisé des cellules de souris. J'avais réalisé les mêmes marquages (avec les mêmes anticorps) dans des cellules humaines et ça fonctionnait parfaitement.

    Si vous voyez une explication, merci de m'éclairer

    -----


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  3. #2
    nowell

    Re : même marquage immunofluorescence dans le vert et le rouge

    Bonsoir,

    e problème vient peut etre quand meme des Ab. Avez vous vérifié de manière indépendante la sélectivité des Ab secondaires et primaires. Parce qu'entre ce que disent les fabricants et la réalité, c'est parfois le jour et la nuit.

    Cordaialement
    Nowell
    Si les faits ne correspondent pas à la théorie, changez les faits. (A. Einstein)

  4. #3
    Flyingbike

    Re : même marquage immunofluorescence dans le vert et le rouge

    il faut faire attention a l'espèce reconnue par un anticorps mais aussi a l'espèce chez qui il est produit. Ex : deux secondaires, un anti chèvre et un anti lapin, anti lapin fait chez la chèvre, il peut y avoir cross réaction.

  5. #4
    Flyingbike

    Re : même marquage immunofluorescence dans le vert et le rouge

    et comme le dit nowell, pour mettre en place du double marquage, il faut commencer par du simple sur des coupes adjacentes pour éliminer les problèmes de spécificité.

  6. #5
    imenely

    Re : même marquage immunofluorescence dans le vert et le rouge

    Citation Envoyé par nowell Voir le message
    e problème vient peut etre quand meme des Ab. Avez vous vérifié de manière indépendante la sélectivité des Ab secondaires et primaires. Parce qu'entre ce que disent les fabricants et la réalité, c'est parfois le jour et la nuit. Nowell
    Non, je ne l'ai pas fait, parce que ça fonctionnait pour les cellules humaines. Je pense que c'est un contrôle qu'il faut que je fasse la prochaine fois

    Citation Envoyé par Flyingbike Voir le message
    il faut faire attention a l'espèce reconnue par un anticorps mais aussi a l'espèce chez qui il est produit. Ex : deux secondaires, un anti chèvre et un anti lapin, anti lapin fait chez la chèvre, il peut y avoir cross réaction.
    Oui c'est ce que j'ai pensé au départ mais après vérification non, les secondaire sont chèvre anti-lapin et chèvre anti-souris.

    Merci de vos réponses

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    fabien.che

    Re : même marquage immunofluorescence dans le vert et le rouge

    Citation Envoyé par imenely Voir le message
    chèvre anti-lapin et chèvre anti-souris.
    Je ne suis guère étonné qu'un primaire fait chez la souris, qui marchait chez l'humain, ne donne plus rien chez... la souris.
    Une autre piste éventuellement à explorer c'est la perméabilisation.
    Dernière modification par Edelweiss68 ; 15/09/2011 à 23h00. Motif: Deux en un.
    The most exciting phrase to hear in science [...] is not 'Eureka' but 'That's funny ...

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  10. #7
    imenely

    Re : même marquage immunofluorescence dans le vert et le rouge

    Citation Envoyé par fabien.che Voir le message
    Je ne suis guère étonné qu'un primaire fait chez la souris, qui marchait chez l'humain, ne donne plus rien chez... la souris.
    Une autre piste éventuellement à explorer c'est la perméabilisation.
    Je ne pense pas que le problème soit là, car le marquage est bien là mais sort le même en vert qu'en rouge...

  11. #8
    fabien.che

    Re : même marquage immunofluorescence dans le vert et le rouge

    Vous parlez de marquages diffus et qui se superposent, alors qu'ils sont sensés avoir des cibles cellulaires disctinctes, c'est signe d'un marquage non spécifique. Ce manque de spécificité, au moins pour un anticorps, peut s'expliquer par le fait d'utiliser un anticorps de souris dirigé contre un épitope de souris.
    Hormis cela, que donnent vos contrôles négatifs (j'entends, le protocole complet mais sans les anticorps primaires) ?
    The most exciting phrase to hear in science [...] is not 'Eureka' but 'That's funny ...

  12. #9
    imenely

    Re : même marquage immunofluorescence dans le vert et le rouge

    Non, en fait j'ai marqué à la fois des mitochondries qui ont un aspect très reconnaissable dans le type cellulaire que j'étudie (ça forme des sortes de patches que je retrouve) et une protéine qui peut être à la fois mitochondriale et diffuse, que je retrouve aussi mais jamais tous les 2 en même temps, c'est comme si j'avais fais du simple marquage. Mes 2 anticorps secondaires (avec 2 fluorochromes différents) reconnaissent un seul anticorps primaire (qui est celui produit chez la souris), ce qui suggère que les 2 anticorps sont anti-IgG de souris mais ce n'est pas ce qui est noté sur mes tubes (aliquots)! Dans le doute, la prochaine fois je vais utiliser un nouveau tube de secondaires anti IgG de lapin.
    Je n'ai pas fait le contrôle négatif secondaires seuls, je le ferais surement la prochaine fois que j'aurais des échantillons

  13. #10
    imenely

    Re : même marquage immunofluorescence dans le vert et le rouge

    En fait, je pense savoir à quoi c'est du, j'ai re-vérifié les anticorps secondaires et il s'avère qu'il y a deux anticorps anti-souris dans la boite: un produit chez la chèvre et l'autre chez le lapin! le hic c'est que sur les aliquots, la provenance n'est pas indiqués!! Donc je pense que cette fois-ci j'ai du "pioché" le mauvais aliquot : lapin anti-souris rouge qui va être reconnu par mon autre secondaire chèvre anti-lapin vert et donc donner le même marquage. Ceci m'amène à une autre question: mon secondaire chèvre anti-lapin vert n'aurait-il pas du reconnaitre mon anticorps primaire quand même ou est-ce que ça peut s'expliquer par l'affinité et la compétition entre les deux anticorps.
    Ceci dit je vais recommander des nouveaux anticorps secondaires pour repartir sur de bonnes bases,
    Merci pour toutes vos réponses

  14. #11
    Flyingbike

    Re : même marquage immunofluorescence dans le vert et le rouge

    hihi c'est ce que je disais

    ce qui peut expliquer ceci c'est que l'anti lapin fait chez la chèvre peut empêcher le lapin anti souris de se fixer sur ton primaire (par gene stérique), et/ou il a une affinité supérieure comme tu le supposes.

  15. #12
    imenely

    Re : même marquage immunofluorescence dans le vert et le rouge

    Citation Envoyé par Flyingbike Voir le message
    hihi c'est ce que je disais
    Oui effectivement

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