même marquage immunofluorescence dans le vert et le rouge

[invite50cb7a9c]

Bonjour,

J'ai réalisé un double marquage immunofluorescent, protéine d'intérêt et protéine mitochondriale et le marquage sort exactement le même, dans un premier temps j'ai pensé que ma protéine se localisait exclusivement dans la mitochondrie. Mais voilà, en marquant la même protéine et une autre protéine non mitochondriale cette fois-ci, le marquage est complètement diffus et les deux marquages se superposent. J'ai pensé que je m'étais trompé dans mes anticorps secondaires mais après vérification, il s'avère que non! donc je ne comprends pas d'où ça peut venir. Je précise que là j'ai utilisé des cellules de souris. J'avais réalisé les mêmes marquages (avec les mêmes anticorps) dans des cellules humaines et ça fonctionnait parfaitement.

Si vous voyez une explication, merci de m'éclairer
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[inviteb3a6feac]

Bonsoir,

e problème vient peut etre quand meme des Ab. Avez vous vérifié de manière indépendante la sélectivité des Ab secondaires et primaires. Parce qu'entre ce que disent les fabricants et la réalité, c'est parfois le jour et la nuit.

Cordaialement
Nowell

[Flyingbike]

il faut faire attention a l'espèce reconnue par un anticorps mais aussi a l'espèce chez qui il est produit. Ex : deux secondaires, un anti chèvre et un anti lapin, anti lapin fait chez la chèvre, il peut y avoir cross réaction.

[Flyingbike]

et comme le dit nowell, pour mettre en place du double marquage, il faut commencer par du simple sur des coupes adjacentes pour éliminer les problèmes de spécificité.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite50cb7a9c]

e problème vient peut etre quand meme des Ab. Avez vous vérifié de manière indépendante la sélectivité des Ab secondaires et primaires. Parce qu'entre ce que disent les fabricants et la réalité, c'est parfois le jour et la nuit. Nowell

Non, je ne l'ai pas fait, parce que ça fonctionnait pour les cellules humaines. Je pense que c'est un contrôle qu'il faut que je fasse la prochaine fois

il faut faire attention a l'espèce reconnue par un anticorps mais aussi a l'espèce chez qui il est produit. Ex : deux secondaires, un anti chèvre et un anti lapin, anti lapin fait chez la chèvre, il peut y avoir cross réaction.

Oui c'est ce que j'ai pensé au départ mais après vérification non, les secondaire sont chèvre anti-lapin et chèvre anti-souris.

Merci de vos réponses

[inviteae6c05c4]

chèvre anti-lapin et chèvre anti-souris.

Je ne suis guère étonné qu'un primaire fait chez la souris, qui marchait chez l'humain, ne donne plus rien chez... la souris.
Une autre piste éventuellement à explorer c'est la perméabilisation.

[invite50cb7a9c]

Je ne suis guère étonné qu'un primaire fait chez la souris, qui marchait chez l'humain, ne donne plus rien chez... la souris.
Une autre piste éventuellement à explorer c'est la perméabilisation.

Je ne pense pas que le problème soit là, car le marquage est bien là mais sort le même en vert qu'en rouge...

[inviteae6c05c4]

Vous parlez de marquages diffus et qui se superposent, alors qu'ils sont sensés avoir des cibles cellulaires disctinctes, c'est signe d'un marquage non spécifique. Ce manque de spécificité, au moins pour un anticorps, peut s'expliquer par le fait d'utiliser un anticorps de souris dirigé contre un épitope de souris.
Hormis cela, que donnent vos contrôles négatifs (j'entends, le protocole complet mais sans les anticorps primaires) ?

[invite50cb7a9c]

Non, en fait j'ai marqué à la fois des mitochondries qui ont un aspect très reconnaissable dans le type cellulaire que j'étudie (ça forme des sortes de patches que je retrouve) et une protéine qui peut être à la fois mitochondriale et diffuse, que je retrouve aussi mais jamais tous les 2 en même temps, c'est comme si j'avais fais du simple marquage. Mes 2 anticorps secondaires (avec 2 fluorochromes différents) reconnaissent un seul anticorps primaire (qui est celui produit chez la souris), ce qui suggère que les 2 anticorps sont anti-IgG de souris mais ce n'est pas ce qui est noté sur mes tubes (aliquots)! Dans le doute, la prochaine fois je vais utiliser un nouveau tube de secondaires anti IgG de lapin.
Je n'ai pas fait le contrôle négatif secondaires seuls, je le ferais surement la prochaine fois que j'aurais des échantillons

[invite50cb7a9c]

En fait, je pense savoir à quoi c'est du, j'ai re-vérifié les anticorps secondaires et il s'avère qu'il y a deux anticorps anti-souris dans la boite: un produit chez la chèvre et l'autre chez le lapin! le hic c'est que sur les aliquots, la provenance n'est pas indiqués!! Donc je pense que cette fois-ci j'ai du "pioché" le mauvais aliquot : lapin anti-souris rouge qui va être reconnu par mon autre secondaire chèvre anti-lapin vert et donc donner le même marquage. Ceci m'amène à une autre question: mon secondaire chèvre anti-lapin vert n'aurait-il pas du reconnaitre mon anticorps primaire quand même ou est-ce que ça peut s'expliquer par l'affinité et la compétition entre les deux anticorps.
Ceci dit je vais recommander des nouveaux anticorps secondaires pour repartir sur de bonnes bases,
Merci pour toutes vos réponses

[Flyingbike]

hihi c'est ce que je disais

ce qui peut expliquer ceci c'est que l'anti lapin fait chez la chèvre peut empêcher le lapin anti souris de se fixer sur ton primaire (par gene stérique), et/ou il a une affinité supérieure comme tu le supposes.

[invite50cb7a9c]

hihi c'est ce que je disais

Oui effectivement