Aides QPCR

[invite02cefc91]

Bonjour,

Je fais appel à vous pour des idées afin de limiter les contaminations ADNg pour de la qRT-PCR.

Une collègue a visiblement des soucis à quantifier un transcrit (gène sans introns) qui visiblement est très très peu abondant. Parfois, elle arrive à l'amplifier parfois non, et on se pose la question entre autre si ce ne serait pas du à la présence d'ADNg.

Donc auriez vous des idées pour éliminer ces éventuelles contaminations ? (hormis un double traitement DNase qui semble insuffisant)

L'utilisation de sondes plutôt que du sybergreen, aiderait il ?

Et ce qui m'intrigue plus, c'est que ce transcrit soit si difficile à détecter. Uniquement détectable à partir d'1 ug d'ARN total, ca ne vous semble pas beaucoup ?

Là, elle me pose une colle pour le moment, j'ai pas de solution à lui apporter malgré mon expérience en qPCR ..

Que pensez vous sinon d'une double amplification ARN comme on peut le faire pour les microarray ? afin d'augmenter le signal ...


Merci d'avance
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[Flyingbike]

1µg d'ARN dans la PCR ? C'est beaucoup !!

Est ce que la RT fonctionne bien ? Faites vous un contrôle de RT sans enzyme ? (s'il n'y a pas de différence c'est que vous amplifiez du génomique)

Quel type d'extraction ?
Normalement la DNase devrait largement suffire.

Avez vous bien vérifié vos amorces ?

[invite02cefc91]

Ah oui, tout ça s'est vérifié.

J'ai l'habitude de faire de la qPCR en routine, mais là je ne vois pas d'où peu venir le problème.
Comme je ne maîtrise pas les gènes qu'étudient ma collègue, j'ai peu de recul !

[Flyingbike]

ben deja est ce que ce gène est bien exprimé ?
Vous avez un contrôle positif ?

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite853321bf]

Bonjour, vous faites quoi comme traitement DNase au juste ?

[invite02cefc91]

J'ai contrôlé tout ce que faisait ma collègue, il y a aucun problème (contrôle, double traitement DNAse), tout va bien.

Moi je réfléchis à faire des cRNA avant la RT pour augmenter la quantité de matrice (bien que cela introduise des biais ...)