Problème en biochimie, 2ème année licence

[invite46b76df0]

Bonjour,
Je sus en pleine révisions pour mes partiels à la rentrée mais j'ai quelques doutes par rapport à des annales que je fais pour mon examen de biochimie. Voici mes questions :
1er : Si j'ai un fragment d'ADN suivant :
5'-AAACTACAATTCCCAGCATGCTCCGCGCCC CTTCGTAAATTGCCATTCTAA-3', qui est utilisé dans une réaction d'amplification par PCR, le couple d'amorces que j'utiliserais pour amplifié sera bien AAACTACAATTCCCA et TTAGAATGGCAATTT ?
2ème : Le traitement de l'ARN par la soude entraine le clivage des liaisons phosphodiesters 3'-5' et produit un mélange de nucléosides 2' et 3' phosphate, c'st bien ça ?
3ème : Lors de la réaction de polyadénylation, le pre-ARNm est clivé en amont ou en aval du signal de polyadénylation ? J'aurais dit en amont ...
Et la présence de cette queue de polyA permet la purifcation des ARNm par chromatographie d'affinité sur une réisine portant des séries de thymines ou de cytosines ? J'aurais dit thymines.
Merci de votre aide
-----

[invitedcfa2657]

Bonjour,

Pour les amorces, faut bien préciser le sens des amorces car ça a son importance: si l'amorce n°1 que vous proposez est de sens 3'-AAACTACAATTCCCA-5', elle ne pourra pas se lier à gauche par complémentarité. Si c'est 5'-AAACTACAATTCCCA-3', elle pourra se lier non pas au brin que vous donnez, mais bien à son brin complémentaire (que vous n'avez pas écrit).

-> attention au sens ! J'aurai dit (dans le cas où vous faites bien une PCR sur un fragment double brin, je ne crois pas que c'est possible sur un seul brin mais je n'en suis pas sur):
3'-TTTGATGTTAAGGGT-5' (elle s'hybride sur le brin que vous avez donné, du côté 5')
&
5'-AAATTGCCATTCTAA-3' (elle s'hybride sur le brin complémentaire du brin que vous avez donné, du côté 3' de ce dernier)

Ainsi, la zone double brin d'intérêt est encadrée par deux amorces qui permettront une PCR de ladite zone. J'espère ne pas m'être trompé ^^

Pour la question 3:
Le clivage est catalysé par l'enzyme CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) et se fait 10 à 30 nucléotides en aval de son site de liaison (donc après). Ce site de liaison est souvent la séquence AAUAAA sur l'ARN, soit le signal de polyadénylation. S'en suit un second clivage qui rapproche l'extremité de l'ARNm du signal polyA (en éliminant une partie du brin en aval du signal), puis la polyadenylate polymerase (PAP) arrive pour faire l'élongation de la queue polyA en ajoutant des A.

[invite46b76df0]

On ne me donne pas le sens de mes amorces dans les annales, c'est pour cela que j'ai hésité aussi.
Pour la question 3, je mets donc bien amont dans la phrase ?
Merci en tout cas !

[invitedcfa2657]

Pour la question 3, je mets donc bien amont dans la phrase ?

Non, normalement c'est en aval (après le signal). Pour faire rapide, un facteur "CPSF" (cleavage and polyadenylation specificity factor) se fixe au niveau du signal AAUAAA, et un autre facteur "CSTF" (Cleavage stimulatory factor ) se fixe sur le pré-ARNm au niveau d'une séquence (appelons la X) en 3' du signal, donc en aval (à droite). D'autres choses viennent s'ajouter, mais au final tout ce beau monde fait qu'il y a clivage entre le signal AAUAAA et X, et non pas exactement au niveau du signal AAUAAA comme on le dit si souvent.

Voyez:



La première partie de l'image figure un ARNm qui a déjà été clivé 10 à 30 nucléotides en aval du signal AAUAAA, un peu après ce que j'ai appelé "X" (la séquence verte sur le dessin). La suite représente le second clivage (comme j'ai expliqué ci-dessus), et montre la zone où la polyadénylation va vraiment démarrer.

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitedcfa2657]

Et pour la question sur la chromato:
http://www.chups.jussieu.fr/polys/biochimie/BGbioch/POLY.Chp.7.7.html

Ce sont donc bien avec des thymines, puisque la complémentarité entre nucléotides c'est bien A/T (et pas A/C ^^)

[invite46b76df0]

Merci pour ces précisions !