Clonage d'un plasmide

[invitee30602e9]

Bonjour,

Je suis devant un exercice où je dois donner les différentes étapes me permettant de construire un plasmide recombiné. Celui-ci ayant deux site de restriction CpoI. Je dois y inserer un gène, mais dans la séquence de part et d'autre du gène je n'ai pas de site de restriction. Comment créer les extrémités débordantes complémentaires à celles du plasmides une fois ouvert?
J'ai en plus sur ce plasmide, un gène de résistance à la Kanamycine, comment se fera son expression? (je pense par des ARN polymérases provenant du génome bactérien)

Merci d'avance
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[Flyingbike]

CpoI n'est pas très courant, c'est d'ailleurs pratique.

Il "suffit" d'amplifier par PCR ce gène, en ajoutant dans les amorces des sites de restriction CpoI. Ensuite, digérer le produit de PCR et le plasmide et assembler le tout.
Pour le gène de résistance il s'exprime comme s'exprimerait n'importe quel gène dans la bactérie.

[invitee30602e9]

Merci beaucoup.