Petite énigme à vous soumettre...

[invitef09b5525]

Question posée par un de mes profs...

Imaginez que vous travaillez dans une société pharmaceutique et que vous avez 20 000 agents pharmacologiques à votre disposition. On vous demande de trouver, le plus rapidement possible, des agents parmi ces 20 000 qui seraient des antagonistes d'un récepteur particulier. Ce récepteur, vous en connaissez la séquence, la structure, la fonctionnalité,... bref vous savez tout de lui mais vous voulez trouver des molécules antagonistes très rapidement.

Comment feriez-vous?
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[Vinc]

Salut!
Que connais tu de ces 20000 molécules (séquences, structures, etc...)?

[Guillmot]

Salut,

Celà m'évoque du criblage haut débit; mais j'attends aussi ta réponse à la question de Vinc

GuiL

[jujuleparigot]

Tu peux faire un plan d'expérience. Tu groupe des substances par paquets de n, 1er plan, tu obtient des groupements plus efficace que les autres...
Tu fais un 2nd plan en groupant des substances par paquets de m (n>m), tu obtient des groupements plus efficaces...
Et ainsi de suite.
Tu peux même trouver des interactions intéressantes entre les substances que tu utilise...
A+

[A voir en vidéo sur Futura]

[Guillmot]

Salut Jujuleparigot,

A quelle(s) méthode(s) penses-tu pour mettre en évidence tes regroupements plus efficaces que les autres ?

GuiL

[Guillmot]

Question posée par un de mes profs...

Imaginez que vous travaillez dans une société pharmaceutique et que vous avez 20 000 agents pharmacologiques à votre disposition. On vous demande de trouver, le plus rapidement possible, des agents parmi ces 20 000 qui seraient des antagonistes d'un récepteur particulier. Ce récepteur, vous en connaissez la séquence, la structure, la fonctionnalité,... bref vous savez tout de lui mais vous voulez trouver des molécules antagonistes très rapidement.

Comment feriez-vous?

Bon je détaille un peu plus mon idée de départ Je pense en effet donc à un criblage haut débit, avec par exemple un criblage in-silicio suivie d'une étude plus poussée des molécules retenues par RMN. En effet, la RMN est une très bonne méthode pour mettre en évidence des intéractions protéines-ligand, et pourrait donc permettre d'obtenir des données fort intéressantes !

Je pense que dans ton énoncée, tu pars d'une chimiothèque de 20.000 molécules.
Etant donné que tu possèdes des données sur la protéine, tu peux plus facilement affiner la recherche de molécules d'intérêt par informatique et rentrant des informations-clés.
Après premier tri, une étude RMN utilisant l'effet NOE te permettrait de mieux caractériser les molécules candidates, afin de savoir si elles se fixent bien sur la protéine, et efectuer une "cartographie" des goupements impliqués dans cette interaction !

GuiL

[jujuleparigot]

Par la méthode du "plan d'expérience", c'est une méthode qui vient de l'agrobiologie et qui a été adoptée dans l'industrie pour tous les problèmes "conplexes" et "non modélisables", comme par exemple l'amélioration de l'acoustique intérieure des automobiles...

L'interet est de ne pas essayer toutes les combinaisons entre les différentes variables, mais seulement certaines données par les tables de plans d'expériences (disponibles sur le net pour les plus simples...)
A+

[Vinc]

Salut!

Bon je détaille un peu plus mon idée de départ Je pense en effet donc à un criblage haut débit, avec par exemple un criblage in-silicio suivie d'une étude plus poussée des molécules retenues par RMN. En effet, la RMN est une très bonne méthode pour mettre en évidence des intéractions protéines-ligand, et pourrait donc permettre d'obtenir des données fort intéressantes !
Je pense que dans ton énoncée, tu pars d'une chimiothèque de 20.000 molécules.
Etant donné que tu possèdes des données sur la protéine, tu peux plus facilement affiner la recherche de molécules d'intérêt par informatique et rentrant des informations-clés.
Après premier tri, une étude RMN utilisant l'effet NOE te permettrait de mieux caractériser les molécules candidates, afin de savoir si elles se fixent bien sur la protéine, et efectuer une "cartographie" des goupements impliqués dans cette interaction !

Je ne suis pas sûr que la RMN soit la meilleure méthode pour ce genre d'étude, c'est une technique très lourde qui demande beaucoup d'analyse après les expériences proprement dites....
En ce qui concerne les molécules à tester, si tu ne connais pas la séquence tu ne peux pas faire de recherche bio info (c'est pour ça que j'ai commencé par demander ce qu'on savait sur ces agents pharmacologiques )!
Il y a pas mal de méthode pour caractériser des intéracions ligand/protéine mais ce n'est pas parce que la molécule se lie au récepteur que c'est un antagoniste.
Bon on peut faire un truc un peu tordu (et peut-être aussi lourd que la RMN en fait) si le récepteur est un R7TM : on chope les cellules et on essaye d'évaluer l'inhibition de la fixation d'un éventuel antagoniste radiomarqué en fonction de la fixation d'un agoniste (car après stimulation, le R7TM perd de l'affinité pour son ligand)....Oui je sais c'est un truc de bargot de faire ça avec plusieurs milliers de molécules. Bon sinon , on peut toujours réfléchir à ca de manière purement fonctionelle : si l'activation du récepteur abouti à la production d'un second messager (par exemple l'IP3), on dose ce second messager avec le ligand et ensuite on rajoute la molécule en espérant observer une diminution de la production de ce second messager...
Donc ouai il y a bien des méthodes mais je ne pense pas que ce soit ça qu'attendent tes profs parce que ce ne sont pas des manip qui se font en claquant des doigts....

[invitef09b5525]

Oui, pour répondre à la question, les agents pharma à ma disposition sont connus (séquence, structure, atc...). On imagine qu'il y en a 20 000 et que j'ai 6 mois pour trouver ce que je cherche.

Merci pour vos réponses

[Guillmot]

Bonjour Vinc,

M'étant "spécialisé" ces derniers temps sur les techniques d'études protéine/ligand en RMN, je me propose de mieux te convaincre de mon raisonnement !

Tout d'abord, mystery_girl vient de nous fournir une donnée supplémentaire, donnée qui, ma foi, me semblait déjà subjective dans son énoncée initiale, et qui confirme mon argument !

Reprenons plus en détails les éléments de mon raisonnement:

- Les éléments pharmacologiques sont connus
- La protéine est connue

Le premier test va donc être un traitement informatique pour supprimer les doublons parmi les 20.000 structures, et sélectionner les molécules susceptibles de se lier à la protéine. Il existe des programmes informatiques permettant ce genre de travail.

Nous avons donc sélectionné parmi nos 20.000 molécules disons... 50 ligands potentiels (soyons généreux !). Il faut désormais trier parmi ces ligands lesquels sont les plus intéressants.

C'est là que l'expérimentation RMN peut être intéressante. Prenons la méthode RMN par différence de transfert de saturation (STD-NMR). Cette méthode présente l'avantage de caractériser les intéractions protéine - ligand en transférant la résonnance des protons de la protéine sur les ligands capables de s'y lier; l'intérêt étant de tester plus spécifiquement cette intéraction.

Le coût, j'en conviens, est important, car la méthode demande des concentrations de ligand importantes (ratio de 1 protéine pour 300 ligands par exemple ...); mais elle est utilisée ! Si la méthode RMN te rebute, et que tu préfères des techniques plus simples de caractérisation de Kd et de Ki (par des tests in vitro), j'ai envie de dire que ces tests restent insatisfaisants, car ne reflètant pas d'informations très poussées sur l'intéraction protéine-ligand, comme une cartographie des groupements mis en jeu dans le ligand, par exemple.

Quand tu dis:

Il y a pas mal de méthode pour caractériser des intérations ligand/protéine mais ce n'est pas parce que la molécule se lie au récepteur que c'est un antagoniste.

Je pense que l'hypothèse de départ, à savoir trouver un antagoniste pharmacologique, suppose ici que l'on sait quel site de fixation permet la liaison d'antagonistes. Mais si ce n'est pas le cas, voilà une faiblesse fort intéressante en effet, à réfléchir !

Ici, la problématique est de surtout porposer une méthode de criblage chimique, tes stratégies sont intéressantes mais j'aimerais y apporter les critiques suivantes :

La problématique de base ne nous donne que deux éléments: une chimiothèque et une protéine. Effectuer des tests concluants sur un troisième élément (le second messager) fausse la problématique de départ, tu me suis ? De plus, je me permets une remarque sur ton idée de radiomarquage, qui ne me semble assez chère aussi, et la seconde méthode, avec le second messager, qui, si testée indépendamment avec chaque molécule, sous-entend ... 20.000 manipulations ? Avec assez de cultures cellulaires pour chaque expérience, extraction des seconds messagers, révélation des protéines ... Est-ce bien réalisable ?

Enfin, nous avons une nouvelle donnée: le problème doit être réglé en 6 mois. Je penche de plus pour ma méthode vu ce délais.

Cordialement,

GuiL

[Vinc]

Salut.

Tout d'abord, mystery_girl vient de nous fournir une donnée supplémentaire, donnée qui, ma foi, me semblait déjà subjective dans son énoncée initiale

C'est la première question que j'ai posé.... ça n'était pas sous entendu dans l'énoncé (selon moi).

- Les éléments pharmacologiques sont connus
- La protéine est connue

Ok...

Le premier test va donc être un traitement informatique pour supprimer les doublons parmi les 20.000 structures, et sélectionner les molécules susceptibles de se lier à la protéine. Il existe des programmes informatiques permettant ce genre de travail.

Ok aussi...mais je commencerai par rechercher les antagonistes déjà connus....

Nous avons donc sélectionné parmi nos 20.000 molécules disons... 50 ligands potentiels (soyons généreux !). Il faut désormais trier parmi ces ligands lesquels sont les plus intéressants..

Moui.....mais j'aurai tendance à revoir ce nombre à la hausse...

C'est là que l'expérimentation RMN peut être intéressante. Prenons la méthode RMN par différence de transfert de saturation (STD-NMR). Cette méthode présente l'avantage de caractériser les intéractions protéine - ligand en transférant la résonnance des protons de la protéine sur les ligands capables de s'y lier; l'intérêt étant de tester plus spécifiquement cette intéraction.

Oui.......mais non. Je ne vois pas ce qu'apportera la RMN! Tu vas trouver des ligands mais pas forcément des antagonistes...

Le coût, j'en conviens, est important, car la méthode demande des concentrations de ligand importantes (ratio de 1 protéine pour 300 ligands par exemple ...); mais elle est utilisée !

On a pas parlé de coût des manips donc pas de problème de ce coté là.

Si la méthode RMN te rebute, et que tu préfères des techniques plus simples de caractérisation de Kd et de Ki (par des tests in vitro), j'ai envie de dire que ces tests restent insatisfaisants, car ne reflètant pas d'informations très poussées sur l'intéraction protéine-ligand, comme une cartographie des groupements mis en jeu dans le ligand, par exemple.

Non la RMN ne me rebute pas .
Ce n'est pas que je préfère les méthodes biochimiques, c'est simplement que c'est ce qui en général utilisé pour ce genre d'étude....Tu veux faire une cartographie des groupements mis en jeu.... Qu'est ce que ça va apporter? Ce qu'on veut c'est savoir si la molécule est un antagoniste ou pas. Faire une carto 3D précise demande une quantité de temps (et de mains) assez hallucinante. Amuse toi bien pour purifier un complexe récepteur/ligand.
Et en plus c'est généralement la cristallo que l'on utilise, ou bien le dichroïsme circulaire éventuellement... Quelqu'un qui fait une thèse de biophysique peut passer ses 3 ou 4 ans de thèse sans sortir avec des résultats valables, c'est à dire sans avoir obtenu la moindre structure 3D de la protéine qu'il essaye de caractériser... Tout ça pour dire que ça prend un temps fou. Alors c'est pour ça que j'ai pensé que passer par les techniques de structures ne sont certainement pas les plus rapides (même si les miennes ne sont pas non plus très véloces).

Je pense que l'hypothèse de départ, à savoir trouver un antagoniste pharmacologique, suppose ici que l'on sait quel site de fixation permet la liaison d'antagonistes. Mais si ce n'est pas le cas, voilà une faiblesse fort intéressante en effet, à réfléchir !.

Ben non je ne vois pas pourquoi...deux antagonistes différents peuvent très bien avoir des sites de fixation différents...si ce n’est des mécanismes de blocages différents.
Il est bien évident que si on connaissait le site unique, ça coulerait de source et on aurait même pas besoin de faire de manip à la limite...la bio info peut se révéler très pratique.

Ici, la problématique est de surtout porposer une méthode de criblage chimique, tes stratégies sont intéressantes mais j'aimerais y apporter les critiques suivantes

:
Je t'en prie

La problématique de base ne nous donne que deux éléments: une chimiothèque et une protéine. Effectuer des tests concluants sur un troisième élément (le second messager) fausse la problématique de départ, tu me suis ?

Non pas du tout.... Je ne vois pas pourquoi! On connais le récepteur, donc on est également censé connaitre son rôle fonctionnel! On fait une seule mesure d'IP3 avec le ligand normal, et on a juste besoin de faire des mesures pour les molécules après pré sélection par bio info....

De plus, je me permets une remarque sur ton idée de radiomarquage, qui ne me semble assez chère aussi, et la seconde méthode, avec le second messager, qui, si testée indépendamment avec chaque molécule, sous-entend ... 20.000 manipulations ? Avec assez de cultures cellulaires pour chaque expérience, extraction des seconds messagers, révélation des protéines ... Est-ce bien réalisable ?

Oui ça serait réalisable (j'ai vu bien pire ) mais ce n'est pas comme ça que j'aurai procédé! Comme je l'ai déjà dit, on est d'accord sur la présélection par bio informatique! Donc tu teste uniquement tes 50 molécules pré sélectionnées.
Et si non, il se poserait exactement le même problème avec la RMN! Tu te vois faire de la RMN sur 20000 molécules?????

Cordialement,

De même

Vinc

[Guillmot]

Hello;

Je vais clarifier mon raisonnement:

Après tri par l'outil informatique de la chimiothèque; nous avons donc 50 (ou plus, au choix ) molécules pré-sélectionnées.

Oui ce sont des ligands potentiels, et tu as bien fait de reprendre les faiblesses de mon raisonnement autour de la question des antagonistes.

Quelques précisions cependant:

La partie RMN, et le group epitope mapping que je suggère permettrait de mieux caractériser l'intéraction protéine-ligand par la suite, ces données moléculaires me semblent importantes pour notre agent pharmacologique au final, ne serai-ce que pou connaître parfaitement son intéraction et éventuellement affiner cette dernière.

Ce n'est pas que je préfère les méthodes biochimiques, c'est simplement que c'est ce qui en général utilisé pour ce genre d'étude....Tu veux faire une cartographie des groupements mis en jeu.... Qu'est ce que ça va apporter? Ce qu'on veut c'est savoir si la molécule est un antagoniste ou pas. Faire une carto 3D précise demande une quantité de temps (et de mains) assez hallucinante. Amuse toi bien pour purifier un complexe récepteur/ligand. Et en plus c'est généralement la cristallo que l'on utilise, ou bien le dichroïsme circulaire éventuellement.

Attention, la RMN se réalise en solution, si tu veux faire une cartographie des groupements mis en jeu, via les données cristallographiques, tu dois faire référence à la méthode CORCEMA, qui via un algorythme établit une carto ligand-récepteur à partir des données cristallo du complexe protéine-ligand.

Ici je ne lance en aucun cas de cristallographie, je me limite aux effets de transfert de saturation en solution !

J'espère avoir mieux recadré ma manip'

GuiL

[Vinc]

Salut.

La partie RMN, et le group epitope mapping que je suggère permettrait de mieux caractériser l'intéraction protéine-ligand par la suite, ces données moléculaires me semblent importantes pour notre agent pharmacologique au final, ne serai-ce que pou connaître parfaitement son intéraction et éventuellement affiner cette dernière.

Désolé je ne vois pas pourquoi.....Par cette méthode, je le répète, tu vas caractériser une interaction entre une molécule et un récepteur! Ok.
Mais quelle est la différence entre un ligand et un antagoniste?? C'est simplement que l'antagoniste va se fixer sur son récepteur sans induire de signal alors je ne vois vraiment pas comment tu pourrais "découvrir" un antagoniste pour un récepteur, sans passer par une approche fonctionelle!!!! Et l'approche fonctionelle, ça n'est pas la RMN qui va te l'apporter...Il faut intégrer ce récepteur dans sa voie de régulation....
On cherche à obtenir des infos sur le rapport fonctionnel d'une molécule et de son récepteur alors à la limite, si on veut obtenir ces infos rapidement, on se fout de la structure et de l'interaction moléculaire entre les deux : ce que l'on veut c'est caractériser une action fonctionelle de la molécule sur le récepteur....

Attention, la RMN se réalise en solution, si tu veux faire une cartographie des groupements mis en jeu, via les données cristallographiques, tu dois faire référence à la méthode CORCEMA, qui via un algorythme établit une carto ligand-récepteur à partir des données cristallo du complexe protéine-ligand..

Heu....non je fais simplement référence au fait que la cristallo est utilisée pour obtenir une structure 3D de protéine...
Sinon oui je sais bien que la RMN utilise une phase liquide...mais j'ai parlé de cristallo un peu plus haut dans mon post précédent et c'est pour ça que j'y faisais référence.....


Ta méthode serait valable mais ici on cherche des interactions récepteur/antagoniste et non pas des interaction simples récepteur/ligand..... L'essentiel réside dans le mot "antagoniste".

A+
Vinc

[Guillmot]

Salut Vinc,

Je crois que l'on s'est mal compris sur mon message #12 de ce fil; inutile de t'énerver donc car nous sommes d'accord au final

Je te remercie d'avoir débattu de cette question avec moi, c'était fort intéressant et m'a permis de mettre à jour mes connaissances sur une telle question.

Cordialement,

GuiL

[Vinc]

Je crois que l'on s'est mal compris sur mon message #12 de ce fil; inutile de t'énerver donc car nous sommes d'accord au final

Ho mais je ne suis pas du tout énervé rassure toi! Je ne vais pas m'énerver pour si peu : la vie est trop courte.... Et de toute façon même si l'on était pas d'accord, ça ne serait pas une raison pour sombrer dans l'agressivité. Je pars du principe que l'on ne peut faire passer aucune idée ou raisonement par la violence, qu'elle soit verbale ou physique.
Désolé si tu as décellé des signes d'énervement, ça n'était vraiment pas le cas...
A+
Vinc