casse tête extraction ARN

[cleville]

Voilà note casse tête ou problème...

nous récoltons 3 tubes contenant 500 cellules végétales chacun (microdissection laser). Ces 3 tubes sont récoltés la même journée.

Chacun de ces tubes subissent un broyage (2min 30 a 20Hz) avec 2 billes en présence de 50uL de tampon RLTplus (Kit RNeasy micro plus)
On rajoute ensuite pour le tube1 300 uL et les tubes 2 et 3: 125uL (avec 20 min de temps de lyse)
puis congélation jusqu'à l'extraction

Lors de l'extraction (kit RNeasy micro plus) on fait tube 1 (500 cellules) et on pool 2 et 3 (donc 1000 cellules)

Au nanodrop on obtient pour le tube 1 une concentration en ARN de 25 a 30ng/uL
tube 2/3 de 3 ng/uL environ

A l'experion (High Sens) les tubes a 1000 ont l'air de meilleur qualité, les 500 on a électrophoregramme quasi plat....et des pics 18S et 25S quasi plat (le gel virtuel donne un smear)....

On a prevu une PCR pour voir éventuellement de l'ADNg qu'il semble y avoir d'après l'experion....et une RT pour voir si on a vraiment de l'ARN entier avec une QPCR derrière. Eventuellement aussi un Ribogreen....

Sachant qu'on a reduit le broyage a 1 min et rendement identique. Tout est RNase free....

Votre avis??????????
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[kamor]

Bonjour,
pour moi 2 possibilités

- Ton broyage n'est peut être pas assez efficace. Vu qu'en augmentant le nombre de cellules, tu as moins d'ARN, ça me parait une bonne piste. As tu déjà essayé de regarder un échantillon après, pour voir l'état de tes cellules ?

- Tu atteints les limites du kit. ça doit être indiqué dans le mode d'emploi, mais ils sont très généreux et cela dépend fortement de ton matériel.

Bon courage, c'est jamais simple les problèmes d'extraction ARN

[cleville]

merci pour ta réponse.
Alors l'an passé, on faisait 3 x 500 cellules dans lequel on mettait dans chaque tube 50 uL de tampon RLT et on poolait les 3. On ne broyait pas, et le rendement était correct (dans mes souvenirs entre 10 et 20 ng/uL pour 14 uL récupérer au final) mais avec le kit RNeasy micro (pas le RNeasy micro plus). Bonne qualité.

Là on voudrait baisser le nombre de cellules à récupérer...donc passer à 1000 voire 500 cellules pour avoir un gain de temps (1500 cellules demande une journée entière). Ceci pour faire de la RTQPCR ensuite...

D'où le casse tête, d'où on ne comprend pas le shmilibilik....