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PCR clonage



  1. #1
    sihambio

    PCR clonage


    ------

    Bonjour,

    je tente de cloner une sequence a partir d'un transcriptome. j'ai désigné des primers pour pecher ma sequence d'une banque ADNc, j'ai obtenu une bande de la bonne taille. ensuite j'ai rajouté des sites de restriction a mes primers, et là j'obtiens plus rien

    pleasee help

    -----

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  3. #2
    malesore

    Re : PCR clonage

    Bonjour,

    Tu as calculé comment ton Tm pour tes amorces avec sites de restriction ? Tu as peut être tout simplement un problème d'hybridation de tes amorces à cause d'un Tm inapproprié
    Seul l'étang calme reflète les étoiles

  4. #3
    Flyingbike

    Re : PCR clonage

    comment as tu procédé ?

    tu as essayé de réamplifier ton produit de PCR avec des amorces contenant des sites ou tu as recommencé a partir de la banque ?
    As tu purifié ton produit de PCR ?
    Comme le dit Malesore, as tu essayé de changer la température d'hybridation ?

  5. #4
    sihambio

    Re : PCR clonage

    mes Tm etait 65 et 68, et j'ai obtenu ma bande a une Tm de 65.
    lorsque j'ai ajouté les sites de restriction les Tm sont devenues :84 et 83, et j'ai essayé la PCR a une T, de 65 et 68, et c la que j'ai rein obtenu.

    J'ai amplié a partir de banque encore une fois,
    J'ai pas purifié mon produit PCR,

  6. #5
    Flyingbike

    Re : PCR clonage

    tes TM sont très élevés.

    pourquoi ne pas essayer d'amplifier avec la seconde paire d'amorces en partant du produit de la première PCR purifié ?

    les amorces sont identiques en dehors de la présence des sites de restriction ?

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    sihambio

    Re : PCR clonage

    mes amorces sont identiques, a part les sites de restcriction, c'est pr ca que les Tm sont élevé, mais est ce que je devais reduire de mes amorces pr que j'aie une Tm convenable?

    La j'ai essayé d'amplifier a partir de mon ancien produit PCR, je viens de runner le gel, et je croise les doigts^^
    mais je comprends pas uen chose, quand on veut rajouter les sites de restriction, qu'elles sont les mesures a prendre en consideration pour ne pas tomber dans ce genre de probleme??

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