Ligation ADN plasmidique insert

[invite599597bb]

Bonjour

Bonjour J'ai un tp à préparer en biologie moléculaire il s'agit d'introduire un insert dans un plasmide
Puis de faire la ligation
On me demande de préparer le protocole ;nous avons un phage m13 en quantité de 20 à 50 ng que l'On fait digérer par une enzyme adéquate puis on traite à la phosphatase alcaline Pour éviter que le plasmide ne se referme sur lui même
On me demande d'avoir 3 fois plus d'insert que de plasmide
je sais que le vecteur fait 7250pb et que je dois résonner en mol
n=m\M =20ng \ (7250x660)
= 4,179.10^-15 mol on multiplie par 3
= 1,2x10^-14mol est donc le nombre de mol que l'on doit avoir pour l'insert
l'insert à une taille de 3195pb
Donc m=n.M= 1,2x10^-14mol x 660x 3195= 26ng
Il faut donc 26 ng d'insert ,

est.ce bon ?


Puis on me dit qu'il faut:
2 microlitre de tampon de ligation (10X)
Et 2,5 U (1microlitre) de t4 DNA ligase
Q.s.p 20microlitre eau

Comment trouver le volume à mettre dans mon tube pour le vecteur et L'insert sachant que leur concentration est inconnu


Aussi, je voulais savoir ce que signifie qsp , U, 10X ???


Merci


Merci
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[invite444a246d]

Je n'ai pas refait les calculs mais le raisonnement semble correct,

Concernant les volumes, ils ne sont pas calculables tant que tu n'as pas la concentration de tes ADN dans les solutions mère.

Pour le tampon, pas de panique, 10X ca veut juste dire qu'il est concentré 10 fois..
Le U de l'enzyme, c'est son activité (de souvenir 1U = 1µmol de susbstrat catalysée en une minute).
Pour qsp, tu trouves la réponse en 2 secondes sur google... "quantité suffisante pour"

Cordialement,

[invite599597bb]

Merci pour cet eclaircissement
du coup je suis arrivée en TP ce matin, tout était déja pret dans des tubes épendorff lol
10X c'est 10 fois concentré mais par rapport à une autre solution non ?


J'ai une autre question On a manipulé pendant notre TP, de l'ADN génomique d'un phage M13 dans lequel on a inserér un fragment d'ADN
et on l'a introduit dans une bactérie de souche E.Coli alors que dans tout les exercices fait en TD c'était des plasmides qui était modifié et intégré dans une bactérie

C'est normal?

[invite444a246d]

Le M13 est un phage filamenteux qui bourgeonne à partir de la membrane bactérienne (pas de lyse donc..)

On s'en sert parfois comme vecteur vecteur d'expression chez Coli par fusions des gènes d'intérêt avec les protéines P8 et P3,

Cham,

[A voir en vidéo sur Futura]

[invitef6c1d3c5]

Merci pour cet eclaircissement
du coup je suis arrivée en TP ce matin, tout était déja pret dans des tubes épendorff lol
10X c'est 10 fois concentré mais par rapport à une autre solution non ?

Non, cela veut dire que la solution est 10x plus concentrée que ce que tu as besoin. Par exemple, si ton tampon doit avoir 150mM de sel, tu fais une solution à 1,5M. Cette solution sert en fait de solution stock (1L par ex). Il suffit alors de la diluer 10x pour avoir la solution finale (du coup avec 1L, tu as 10L).