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Protocole de purification d'une protéine, vos avis



  1. #1
    Mims69

    Protocole de purification d'une protéine, vos avis

    Bonjour,
    Je suis étudiant en L3, j'ai un devoir noté dans lequel, je dois présenté le protocole de purification de la beta galactosidase de ecoli.
    je dois effectuer au moins une chromatographie et définir des concentrations de chaque solution précisement
    Je voulais des avis, des conseils, savoir ce qu'il y a a modifier

    voici mon protocole:

    Nous avons des bactéries présentes dans un milieu nutritif LB


    Nous prélevons 30 ml de notre bouillon de culture que nous mettons à centrifuger 10 minutes à 3000g.
    Nos bactéries sont alors concentrer dans le culot. Nous éliminons le surnagent au maximum.
    PROTOCOLE DE Lyse cellulaire
    Notre culot est repris avec une solution de lyse.
    Cette solution de lyse est composée de :

    - EDTA concentrée à 2mM
    - Inhibiteur PMSF
    PMSF inhibe toutes les sérines protéases
    - Tampon Tris-HCl
    A pH=7.5 et de concentration de 0.1M à 4°C
    - Rôle : lors de la lyse cellulaire, les protéases susceptibles de dégrader nos protéines. Pour éviter la dégradation de notre Béta galactosidase, il faut un pH élevé (basique).
    - TRITON X100 (je ne sais pas quel concentration établir)

    - Lysozyme
    Dégrade les peptidoglycanes des parois bactérienne 10mg /ml


    Extraction de la protéine

    Le lysat cellulaire est centrifugé 20 minutes à 13 000g( je ne sais pas si ce n'est pas trop élevé)
    Dans le culot il y a alors, les débris cellulaires.
    Le surnagent comporte alors toutes les protéines d’intérêt, ainsi que l’ADN et éventuellement des ribosomes.
    Le surnagent est mis en contact d’une solution de sulfate d’ammonium concentré à 40%.
    JE NE SAIS PAS SI A CETTE ÉTAPE LES RIBOSOMES SONT ILS PRESENT DANS LA SOLUTION PROTEIQUE APRES PRECIPITATION AU SULFATE D’AMMONIUM ?

    On réalise une centrifugation 20minutes 13000g, obtention de 2 phases :
    -Culot =protéines
    -Surnagent =ADN
    On élimine le surnagent. Le culot est remis en suspension par une solution de sulfate d’ammonium pour éliminer la présence éventuelle d’ADN.
    On élimine le surnagent et on récupère la solution de protéines.

    Séparation des protéines

    La beta gal possede un pHi= 4.6 est le pH auquel la protéine possède une charge neutre.
    Lorsque la protéine est mise dans un tampon dont le pH est supérieur au pHi (pH > pHi), la protéine devient globalement chargé négativement.
    Tampon phosphate (C= quel concentration ???? ) de pH=7.5

    On introduit un volume de tampon phosphate à notre solution de protéine afin que la protéine soit chargée négativement et qu’elle adhère au support de DEAE-cellulose chargée positivement.
    Comment déterminer la Quantité de DEAE

    Nous faisons passer notre solution de protéine à travers la colonne échangeuse d’ion, toutes les protéines chargées négativement vont adhérer au support.
    on réalise l'élution Elution des protéines non retenues par le support avec une solution tampon phosphate (on m'a parlé de pH décroissant ?)
    On récupère les protéines dans des fractions.
    on réalise l'Elution des protéines adhérée avec un tampon de pH inférieure au pHi de la beta galactosidase (avec un pH décroissant ?) celle est chargée positivement et se décroche du support.
    Pour chaque fraction récoltée, on mesure l’activité enzymatique pour repérer la solution la plus active en beta galactosidase


    Ensuite, je voulais réaliser une chromatographie d'exclusion

    Le pool des protéines est purifié au travers d’une chromatographie d’exclusion
    SEPHADEX G-200 dont les pores sont perméables aux protéines de tailles comprises entre
    5-600 kDa la protéine d'interet etant de 400kDa environ



    MERCI

    -----


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  3. #2
    Yoyo

    Re : Protocole de purification d'une protéine, vos avis

    Salut

    Moi je rajouterai juste une RNASe et DNAse à ton échantillon pour me débarassé de l'ADN et l'ARN. Si tu veux garder l'activité beta-gal il ne vaux mieux pas la précipiter sinon ca risque d'etre difficile.
    Apres l'étape sur la colonne monoQ ca me semble une très bonne idée. Tu pourrais faire une gel filtration avant pour ne garder que les fractions contenant ta protéine si tu veux.

    YOyo

  4. #3
    Pfhoryan

    Re : Protocole de purification d'une protéine, vos avis

    Citation Envoyé par Mims69 Voir le message
    Le surnagent est mis en contact d’une solution de sulfate d’ammonium concentré à 40%.
    Elle précipite à combiende % la beta-gal?

    Citation Envoyé par Mims69 Voir le message
    -Culot =protéines
    -Surnagent =ADN
    DNAse +RNAse comme suggéré par Yoyo pour se faciliter la vie.


    Citation Envoyé par Mims69 Voir le message
    La beta gal possede un pHi= 4.6 est le pH auquel la protéine possède une charge neutre.
    pHi ou pI (point isoélectrique)?


    Citation Envoyé par Mims69 Voir le message
    Tampon phosphate (C= quel concentration ???? ) de pH=7.5
    100 mM c'est classique.

    Citation Envoyé par Mims69 Voir le message
    Comment déterminer la Quantité de DEAE
    Cette résine a une capacité en mg de protéine par ml de résine. ça dépend donc de la quantité de protéine en jeu.

    Citation Envoyé par Mims69 Voir le message
    on réalise l'élution Elution des protéines non retenues par le support avec une solution tampon phosphate (on m'a parlé de pH décroissant ?)
    Ou un gradient de sel 0 à 500 mM NaCl.


    Citation Envoyé par Mims69 Voir le message
    Pour chaque fraction récoltée, on mesure l’activité enzymatique pour repérer la solution la plus active en beta galactosidase
    Ce serait bien de décrire comment est mesurée l'activité, ainsi que la méthode de dosage de protéine. Et il faudrait mesurer l'activité et la quantité en protéine à chaque étape, avant le sulfate d'ammonium, après...
    “if something happened it’s probably possible.” Peter Coney

  5. #4
    Pfhoryan

    Re : Protocole de purification d'une protéine, vos avis

    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    Apres l'étape sur la colonne monoQ ca me semble une très bonne idée.
    C'est pas une monoQ (échangeuse forte) mais une DEAE (échangeuse faible)
    Q=quaternary=charge permanente, DEAE=diethylaminoethyl=déproto nable

    Cela dit, une monoQ après la gel filtration est généralement une bonne idée. ça permet de faire une étape de polishing et de concentrer l'enzyme après la gelfi.
    précipitation => dialyse (ah oui, penser à dialyser avant l'échangeuse d'ions) => DEAE => Gel Fi => MonoQ => dialyse => ultrafiltration.
    “if something happened it’s probably possible.” Peter Coney

  6. #5
    Mims69

    Re : Protocole de purification d'une protéine, vos avis

    Citation Envoyé par Yoyo Voir le message
    Salut

    Moi je rajouterai juste une RNASe et DNAse à ton échantillon pour me débarassé de l'ADN et l'ARN. Si tu veux garder l'activité beta-gal il ne vaux mieux pas la précipiter sinon ca risque d'etre difficile.
    Apres l'étape sur la colonne monoQ ca me semble une très bonne idée. Tu pourrais faire une gel filtration avant pour ne garder que les fractions contenant ta protéine si tu veux.

    YOyo
    Oui je souhaitais mesurer lactivité de la beta galactisidase
    Pour vérifier dans quelle fraction elle est majoritairement recueillies
    Et si mes fractions après précipitation était mis en contact d'une solution de mgcl2
    On pourrait rétablir la structure de la protéines et ainsii avoir une meilleure activité
    Enzymatique non ?

    J'avais penser aux DNAse et rnase et comment faire pour éliminer les nucléotide
    Je recentrifuge. Nouveau ?

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Mims69

    Re : Protocole de purification d'une protéine, vos avis

    Citation Envoyé par Pfhoryan Voir le message
    Elle précipite à combiende % la beta-gal?
    justement, je ne sais pas comment établir le pourcentage

    Citation Envoyé par Pfhoryan Voir le message

    pHi ou pI (point isoélectrique)?
    C'est la meme chose non ?
    je veux utiliser un tampon phosphate de pH=7.5 donc un pH superieur au pHi pour pourvoir rendre la beta-galactosidase chargée négativement et qu'elle adhere au support de DEAE chargé positivement


    Citation Envoyé par Pfhoryan Voir le message
    Cette résine a une capacité en mg de protéine par ml de résine. ça dépend donc de la quantité de protéine en jeu.
    Je ne connais pas ma quantité de protéine dois-je réaliser une gamme étalon pour déterminer les quantité de protéines de mes solutions ?

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  10. #7
    Mims69

    Re : Protocole de purification d'une protéine, vos avis

    Citation Envoyé par Pfhoryan Voir le message
    C'est pas une monoQ (échangeuse forte) mais une DEAE (échangeuse faible)
    Q=quaternary=charge permanente, DEAE=diethylaminoethyl=déproto nable

    Cela dit, une monoQ après la gel filtration est généralement une bonne idée. ça permet de faire une étape de polishing et de concentrer l'enzyme après la gelfi.
    précipitation => dialyse (ah oui, penser à dialyser avant l'échangeuse d'ions) => DEAE => Gel Fi => MonoQ => dialyse => ultrafiltration.
    A quoi cela sert-il de dialyser ?

  11. #8
    Pfhoryan

    Re : Protocole de purification d'une protéine, vos avis

    Citation Envoyé par Mims69 Voir le message
    justement, je ne sais pas comment établir le pourcentage
    Rechercher dans la littérature ou l'établir expérimentalement.

    Citation Envoyé par Mims69 Voir le message
    C'est la meme chose non ?
    Oui, je ne connaissais pas la deuxième dénomination: potentiel hydrogène isoélectrique

    Citation Envoyé par Mims69 Voir le message
    Je ne connais pas ma quantité de protéine dois-je réaliser une gamme étalon pour déterminer les quantité de protéines de mes solutions ?
    Pour faire un bilan c'est mieux.
    “if something happened it’s probably possible.” Peter Coney

  12. #9
    Pfhoryan

    Re : Protocole de purification d'une protéine, vos avis

    Citation Envoyé par Mims69 Voir le message
    A quoi cela sert-il de dialyser ?
    à éliminer le sulfate d'ammonium de la précipitation. Si la concentration en sel est trop élevée, la protéine ne s'accrochera pas à l'échangeuse d'ions.
    “if something happened it’s probably possible.” Peter Coney

  13. #10
    Doum80

    Re : Protocole de purification d'une protéine, vos avis

    Heureusement que vous devez rendre cette présentation orale pour le 30 mai.

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