Bonjour,
Je suis étudiant en L3, j'ai un devoir noté dans lequel, je dois présenté le protocole de purification de la beta galactosidase de ecoli.
je dois effectuer au moins une chromatographie et définir des concentrations de chaque solution précisement
Je voulais des avis, des conseils, savoir ce qu'il y a a modifier
voici mon protocole:
Nous avons des bactéries présentes dans un milieu nutritif LB
Nous prélevons 30 ml de notre bouillon de culture que nous mettons à centrifuger 10 minutes à 3000g.
Nos bactéries sont alors concentrer dans le culot. Nous éliminons le surnagent au maximum.
PROTOCOLE DE Lyse cellulaire
Notre culot est repris avec une solution de lyse.
Cette solution de lyse est composée de :
- EDTA concentrée à 2mM
- Inhibiteur PMSF
PMSF inhibe toutes les sérines protéases
- Tampon Tris-HCl
A pH=7.5 et de concentration de 0.1M à 4°C
- Rôle : lors de la lyse cellulaire, les protéases susceptibles de dégrader nos protéines. Pour éviter la dégradation de notre Béta galactosidase, il faut un pH élevé (basique).
- TRITON X100 (je ne sais pas quel concentration établir)
- Lysozyme
Dégrade les peptidoglycanes des parois bactérienne 10mg /ml
Extraction de la protéine
Le lysat cellulaire est centrifugé 20 minutes à 13 000g( je ne sais pas si ce n'est pas trop élevé)
Dans le culot il y a alors, les débris cellulaires.
Le surnagent comporte alors toutes les protéines d’intérêt, ainsi que l’ADN et éventuellement des ribosomes.
Le surnagent est mis en contact d’une solution de sulfate d’ammonium concentré à 40%.
JE NE SAIS PAS SI A CETTE ÉTAPE LES RIBOSOMES SONT ILS PRESENT DANS LA SOLUTION PROTEIQUE APRES PRECIPITATION AU SULFATE D’AMMONIUM ?
On réalise une centrifugation 20minutes 13000g, obtention de 2 phases :
-Culot =protéines
-Surnagent =ADN
On élimine le surnagent. Le culot est remis en suspension par une solution de sulfate d’ammonium pour éliminer la présence éventuelle d’ADN.
On élimine le surnagent et on récupère la solution de protéines.
Séparation des protéines
La beta gal possede un pHi= 4.6 est le pH auquel la protéine possède une charge neutre.
Lorsque la protéine est mise dans un tampon dont le pH est supérieur au pHi (pH > pHi), la protéine devient globalement chargé négativement.
Tampon phosphate (C= quel concentration ???? ) de pH=7.5
On introduit un volume de tampon phosphate à notre solution de protéine afin que la protéine soit chargée négativement et qu’elle adhère au support de DEAE-cellulose chargée positivement.
Comment déterminer la Quantité de DEAE
Nous faisons passer notre solution de protéine à travers la colonne échangeuse d’ion, toutes les protéines chargées négativement vont adhérer au support.
on réalise l'élution Elution des protéines non retenues par le support avec une solution tampon phosphate (on m'a parlé de pH décroissant ?)
On récupère les protéines dans des fractions.
on réalise l'Elution des protéines adhérée avec un tampon de pH inférieure au pHi de la beta galactosidase (avec un pH décroissant ?) celle est chargée positivement et se décroche du support.
Pour chaque fraction récoltée, on mesure l’activité enzymatique pour repérer la solution la plus active en beta galactosidase
Ensuite, je voulais réaliser une chromatographie d'exclusion
Le pool des protéines est purifié au travers d’une chromatographie d’exclusion
SEPHADEX G-200 dont les pores sont perméables aux protéines de tailles comprises entre
5-600 kDa la protéine d'interet etant de 400kDa environ
MERCI
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Envoyé par Mims69 
