contamination PCR

[invite5986dd63]

Bonjour,
je suis technicienne et j'ai besoin de votre avis.Je me retrouve avec des séries de contamination de mes témoins négatifs dans mes PCR. Le probleme c'est que j'amplifie du 16s et du 18s, donc la moindre contamination se voit. J'ai fait un test pour trouver d'où ca vient, visiblement pour la 16s ce sont les dNTP. Pour la 18s, j'avais des consommables et les primers, mais le temoins avec tous produits neuf a eu un temoin negatif nikel. J'ai donc lancé tout de suite derrière une PCR sur mes échantillons avec ses bons produits, et je me retrouve de nouveau avec une contamination. Je ne sais plus quoi penser, je ne sais plus dans quel sens prendre le probléme.
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[inviteeb43014d]

Contrôle négatif : Tampon, DNTPs, Polymerase, Primers => Normalement pas d'amplifications => Si oui => Contaminant

Si tu as une bande dans un contrôle négatif, c'est que tu as eu une amplification ce qui veut dire que y avait du "template" (de l'ADN matrice) dans ton tube.

En tout cas, c'est pas normal que tu aies une amlification car ton témoin négatif doit être EXACTEMENT le même entre 16S et 18S, la seule chose qui change, c'est les primers (suffit donc de te refaire un user stock, tes primers 16S sont contaminés par de la matrice)

[invite5986dd63]

oui c'est bien ce que j'ai comme temoin negatif, et il amplifie de nouveau alors que la pcr precedente non avec tout les mêmes produits qui étaient tout neuf. Ca fait 10 ans que j'en fait donc les precautions je les connais et je les prend 2 fois plus quand j'ai des soucis de contamination alors comment puis je avoir un temoin negatif qui amplifie une fois sur 2

[inviteeb43014d]

Y a pas 50 solutions, soit c'est dû à tes primers (ca expliquerait pourquoi tu aies le problème seulement avec le 16S) => donc la tu changes ton stock

Un autre solution, c'est que tes tubes PCR soient pas autoclavé

La dernière que je vois, c'est que tes primers sont capables de s'autoamplifier (dans ce cas là, regarde si y a un recouvrement de tes primers)


Pour moi, y a pas d'autres choses (a moins que tu postillonnes comme une malade dans tes tubes, ce qui m étonnerait fort)

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite5986dd63]

Non, j'ai dû mal m'exprimer, le 16s c'est réglé c'était les dNTP, c'est le le 18s qui ne va pas. Pourtant c'est une manip de routine et nous n'avons jamais eu de problème. Les tubes PCR je me suis posées la question, j'ai appris qu'il y avait eu des soucis sur l'autoclave y a 15 jours (heterogenité de la température au sein de l'appareil), mais j'ai utilisé la même boite de tube, pour le test dont le temoin été negatif et pour cette nouvelle serie où le temoin est de nouveau amplifié. vous pensez que si c'est un probléme d'autoclave la contamination pourrait ne pas être presente sur tous les tubes et ca expliquerait que ce soit alléatoire?

[inviteeb43014d]

En principe, c'est possible que la contamination des tubes PCR soit aléatoire. Idem pour les tips que tu utilises.

En pratique, les chance que le contrôle négatif deviennent positif à cause de ça est peu probable (moi j'utilise des tubes non autoclavé et j'ai jamais eu aucun problème). En effet, il faut que les primers puissent tous les deux s'hybrider sur la matrice "contaminante" (plus ils sont longs, plus ils sont spécifiques).

Mnt, je le répète, si j'étais toi, je referais mon stock de primers car c'est la seule variante entre ton amplification 16S et 18S. Si tu as pas eu de problèmes pour la 18S, tu ne devrais pas en avoir pour la 16S. Le problème vient donc le plus probablement de tes primers.

Pense quand même a vérifier si tes primers peuvent s'autoamplifier (recouvrement) même si je doute que ce soit ça.

Tu attend une bande a cb de kB pour tes amplifications avec ces primers la ? Et ta bande du controle négatif, elle est a cb de kb ?

Ps : Tu peux toujours demander les tips et les tubes de qlq d'autres pour 1 manip, nettoie aussi bien ta pipette (a l alcool). Si on contrôle négatif est toujours positif, tu peux écarter ce problème là.

[invite5986dd63]

C'est toujours la 18s qui pose probléme
POur les primers, j'ai en repris un lot neuf que j'ai remis en suspention donc ca ne peut pas etre ca sauf si l'eau mais c'est la meme que celle utilisé dans la pcr dont les temoins etaient negatifs.
A savoir que dans notre laboratoire des champignons sont mis en culture (pas dans la laverie où il y a l'autoclave bien sur mais n'est ce pas possible que les tubes aient été contaminés par l'air et que l’autoclave n'ait pas tout détruit)
Je rappelle qu'il s'agit de l'its des champignons donc super general le moindre adn de champignons (spore etc ) sera amplifié.
Je precise aussi que je ne suis pas la seule, que la cahute pcr a été nettoyé les pipettes desinfectés, et les tips sont acheté steriles et ouvert sous la hotte et le tout subit les UV pendant, 20 min.
POur les amorces on a deja verifié pas d'autoamplification.
Le produit PCR attendu est de 400pb et le témoin est bien a ce niveau malheureusement comme le temoin positif

[inviteeb43014d]

Dernière solution : va voir ton boss (ou un collègue) et demande lui, mais il va te dire exactement la même chose que je viens de te dire

Comme je te l'ai dit, si tu as un contaminant dans un PCR, y a pas 50 solutions (surtout si c'est spécifique du 16S).

Bonne chance,

Cordialement, Seron

[Flyingbike]

Il ne faut pas se limiter à un problème de réactif. Je sais que les problèmes de contamination peuvent rendre fou, allant jusqu'à te faire dire des incantations et faire des sacrifices pour s'attirer la bienveillance de la divinité en charge des PCR.

Si tu as écarté un problème de réactif, essaie de changer de lieu et de pipettes. (Une voisine vient faire ses PCR chez moi, ça marche mieux, de même un collègue qui fait de l'extraction d'ADN de biopsies ET des maxiprep quotidiennement a deux paillasses distinctes et du matériel propre à chaque manip).

La PCR est une technique très sensible il suffit de peu.

[invite98839ab8]

Salut,

j'ai également eu des soucis de ce genre mais avec le 16S uniquement.
Apres de nombreux tests il c'est avéré que le problème venait de la Taq que nous utilisions.
Non pas du lot mais réellement du "type" de taq. Peut être auriez vous à disposition un autre polymérase pour tester ?
J'avais un peu creuser ce problème et j'avais réussi à trouver quelques publis la dessus ( sur la présence d'ADN génomique et/ou d'ARNr dans les Taqs).
Vous devriez même trouver un protocole décrivant un pré-traitement de la Taq avant la PCR.
Si besoin je dois avoir les ref quelque part.

Bon courage en tout cas

-A-

[invite5986dd63]

Bonjour, je reviens avec des nouvelles de mon problème.
Après avoir consulté mes collègues d'autres équipes ils s’avèrent que toute les personnes du laboratoires travaillant sur des communautés totales ont eu des contaminations (mais nous semblons être les seuls a être dérangé par cela, bref...), il ne s'agit donc pas d'une contamination spécifique du 16s puisqu'elle concerne les ITS champignons et bactérie, les 16s et 18s.
POur la Taq 3 fournisseurs différents et chacun testé sur différent lot.
Nous sommes maintenant persuadé que c'est une contamination de l'air. nous travaillons pourtant pour faire notre mix sous une hotte dans une cahutte n'ayant jamais contenu de solutions d'ADN.
Nous avons passé donc lavé toutes nos paillasses à l'HCl, au DNAoff, et passé une machine pulverisants un produits détruisant bactérie et champignons. Hélas les contaminations étaient toujours là. Pour confirmer notre thèse, nous avons été travaillé dans un autre batiment, pour preparer le mix, une série d’échantillon chez nos collègues et une série d’échantillon sur le même mix mais dans notre laboratoire et oui la contamination n'est présente que chez nous.
Nous avons un laboratoire, sans fenêtre avec une circulation d'air par flux (j'avoue n'avoir rien compris), bref d’après l'architecte c’était génial, mais nous sommes maintenant convaincu que le problème vient de la. Pour la contamination nous avons fait un séquençage , nous verrons ce que cela va donner, mais je ne sais plus quoi faire. Faire les PCR chez les voisins? ils vont être content, à nous seul on en fait au moins par jour.