bonsoir,
je dois cloner les produits de digestion de la mutagenèse (insert ADN) dans le vecteur PGEX4T1 en transformant les bactéries compétentes DH5α J'ai trouvé des clones sur un milieu 2YT/AMP j'ai fait une miniprep pour extraire le plasmide recombinant simplement sur le gel les produits sont piégés dans le puits j'ai refait la manip à plusieurs reprises je trouve toujours le même résultat avec un smear Aidez moi que devrais je faire?
cordialement,
mkh
Salut,
Ce que tu dis n'est pas très clair... Tu as fait ton clonage et ta transfo sur des DH5alpha, fait une culture liquide et une miniprep. Jusque la ok.
Mais tu as déposé quoi sur ton gel? Ta miniprep? As tu fais une PCR sur la miniprep ou une digestion pour le deposer sur ton gel? Si tu as deposé directement le produit de ta miniprep, je ne trouve pas étonnant que tu ne vois rien de bon...
Ton smear vient des bactéries je pense. Et ce que tu as dans tes puits c'est probablement ton plasmide avec l ADNg de tes bacteries.
A quel concentration est ton gel?
Quel type de clonage fais tu, un Gateway? un GoldenGate? ou un classique restriction/ligation? (autre?)
Bob
Je vérifie mes preps en faisant migrer sur gel directement....si c'est fait proprement, je ne vois pas en quoi c'est dérangeant ! Bien sûr la bande est ondulée, smear sur les bords...mais ça confirme bien l'extraction du plasmide (la double confirmation serait la digestion, la triple, une pcr...encore faut-il avoir les primers). Quant au blocage dans le puit, c'est effectivement un soucis d'ADNg le plus souvent...mais que tu ne devrais pas rencontrer en miniprep. Peut-être es-tu un peu brutal au cours du protocol et du coup l'ADNg se détache des membranes....ce qui fait que tu le retrouves plus tard
bonjour,
ce que j'ai mis sur gel 0.7% est le produit de miniprep il s'agit d'un clonage classique ce qui m'étonne c'est que les produits sont toujours piégés dans le puits il n’y a rien en dessous juste un smear.
Merci pour votre collaboration
cordialement,
mkh
