Expression brainbow après recombinaison CRE-LOX dans embryons de souris.

[wolfgangouille]

Bonjour à tous, ça faisait longtemps !

Je vous dis tout de suite ce que je veux faire histoire qu'en lisant la suite du message votre reflexion aille dans le bon sens : je voudrais avoir des embryons de souris (genre E16) qui exprimeraient déjà le construct brainbow.

Alors je me rappelle plus trop comment on génère les modèles de souris voici ce que je pense : je vois pas d'autres solutions qu'un Breeding souris CRE avec souris Brainbow, mais

-est ce que les souris CRE expriment la recombinase de manière inductible ou constitutive?
-si inductible, peut on induire l'expression dans les embryons d'une maman souris encore prégnante?
-si constitutive je risque d'avoir une recombinaison très tôt et donc je vais avoir toutes les cellules filles après un évènement de recombinaison d'une même couleur?
-est ce que les deux partenaires sont toujours hétérozygotes? Si j'avais deux souris homozygotes, alors 100% de la descendance serait du bon phénotype non?
-dans les embryons après recombinaison, combien de temps il faudrait pour que les protéines fluorescentes soient produites? Il semble que le promoteur Thy1 dans brainbow soit actif pendant l’embryogenèse mais j'en sais pas grand chose pour dire vrai.


Voilà je serai grandement reconnaissant même à celui ou celle qui m'apportera une réponse partielle !

Renaud
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[nowell]

Bonjour

La plus complète des réponse vous sera donnée en lisant la publi de Livet et al, Nature,2007
Si vous ne la trouvez pas, envoyez moi votre e-mail en message privé, je vous l'enverrai.

Cordialement
Nowell

[wolfgangouille]

Merci beaucoup,

J'avais survolé cet article mais n'avais trouvé aucune réponse concernant en particulier :

-le temps nécessaire après recombinaison pour exprimer les protéines fluorescente (ils se placent à des temps variables par exemple 79 jours après injection à P0, mais ils ne disent pas qu'on ne peut pas le faire avant). Dans un autre papier "Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice." ils disent que le promoteur est surtout actif à partir de P6 donc c'est surtout ça qui va être limitant de toutes façons. Le truc c'est que moi je veux avoir des cultures de neurones embryonnaires et je sais pas si parler de P6 a encore du sens dans ce contexte !

-ces histoires de croisement ; ils étudient des souris hétérozygotes pour cre et brainbow ok mais ils ne précisent pas le génotype des parents ! Est-ce si évident?

J'ai peut-être trouvé quelque chose de mieux pour moi plutôt que de faire les croisements avec des souris Cre : comme je récupère les neurones et qu'ils poussent in vitro, je peux faire une simple transfection d'un vecteur CMV-Cre qui sera exprimé temporairement, non?

A+ !

[nowell]

Quel est l'intérêt pour vous d'avoir des brainbow ?
Vous avez nécessairement besoin d'une expression aléatoire des protéines de fusion ? Ou une simple expression d'une couleur suffit ?

nowell

[A voir en vidéo sur Futura]

[wolfgangouille]

L’intérêt d'avoir un brainbow serait tout simplement le même que dans des coupes organotypiques. Je travaille sur des réseaux de neurones artificiels et je voudrais caractériser ces systèmes en particulier au niveau de l'arborization des neurones et de l'interconnectivité en fonction des différents contraintes expérimentales que je peux leur imposer. Et donc je peux discriminer qui est qui plus facilement avec un brainbow.

Renaud

[nowell]

Un CMV-Cre sur des constructions brainbow me parait être une bonne idée.
Si vous infectez vos neurones avec un retro ou un lenti, vous aurez même la chance d'avoir une expression théoriquement infinie, grâce à l'intégration de l'ADN apporté, contrairement à un plasmide qui resterait épisomal.

Parler de Post natal "n" n'a en effet in vitro aucun sens, cela dépendant d'un ensemble de facteurs présents dans la niche de maturation des neurones in vivo... Même si on pourrait évaluer un niveau de densification des épines ou de l'arborisation neuronale in vitro, il n'emp^che que vous n'avez pas de culture 3D, sauf si vous le faites en plasma clot??

Cordialement
Nowell

[Flyingbike]

de façon générale pour le système CRE : le délai de recombinaison est variable et dépend de la cible et du promoteur qui controle la CRE. De même, pour la date minimale de recombinaison dans le cas d'une CRE inductible dépend de la cinétique d'expression de son promoteur, de la dose d'inductant etc. Dans tous les cas il faudra essayer.

Effectivement si tu bosses in vitro, une CRE délivrée par transfection on infection virale te simplifie pas mal le travail.

[wolfgangouille]

Merci beaucoup pour vos réponse,

Si vous infectez vos neurones avec un retro ou un lenti, vous aurez même la chance d'avoir une expression théoriquement infinie, grâce à l'intégration de l'ADN apporté, contrairement à un plasmide qui resterait épisomal.

Justement je n'ai pas besoin d'une expression continue, j'ai juste besoin d'une expression transitoire de recombinase.

Même si on pourrait évaluer un niveau de densification des épines ou de l'arborisation neuronale in vitro, il n'empêche que vous n'avez pas de culture 3D, sauf si vous le faites en plasma clot??

A priori on reste en 2D, mais on place les neurones dans des systèmes microfluidiques en combinaison avec des micro-patterns de poly-lysine ce qui crée des réseaux moins "bouillie" qu'une simple culture.

Effectivement si tu bosses in vitro, une CRE délivrée par transfection on infection virale te simplifie pas mal le travail.

Cela dit si j'avais des embryons ayant déjà la Cre inductible en même temps que brainbow, je n'aurais qu'à perfuser du tamoxifène dans mes chambres de microflu non? Ce qui niveau difficulté serait vraiment minimal. Je pense pas qu'avoir ces souris soit possible à moins d'avoir une animalerie qui s'occupe de maintenir la lignée. D'habitude les souris on les commande gestantes, mais je pense pas qu'on puisse commander une souris gestante avec des embryons brainbow +/- Cre +/- dedans (par ex. croisement brainbow +/+ Cre +/+ avec WT) qu'en pensez-vous?

Merci encore

Renaud

[Flyingbike]

Cela dit si j'avais des embryons ayant déjà la Cre inductible en même temps que brainbow, je n'aurais qu'à perfuser du tamoxifène dans mes chambres de microflu non? Ce qui niveau difficulté serait vraiment minimal. Je pense pas qu'avoir ces souris soit possible à moins d'avoir une animalerie qui s'occupe de maintenir la lignée. D'habitude les souris on les commande gestantes, mais je pense pas qu'on puisse commander une souris gestante avec des embryons brainbow +/- Cre +/- dedans (par ex. croisement brainbow +/+ Cre +/+ avec WT) qu'en pensez-vous?

N'oublie pas qu'il existe peut etre plusieurs milliers de souris CRE, selon la nature de la recombinase (inductible ou non) et du promoteur (tissu spécifique, ubiquitaire, inductible, etc.).

Je n'imagine même pas le prix d'une femelle gestante accouplée avec un mâle CRE quelque chose et la logistique qu'il faut développer (même si une lignée de souris exprimant CRE dans les neurones est facile à trouver). Si tu n'as pas d'animalerie essaie plutot l'approche in vivo pure.

[wolfgangouille]

Tu veux dire "in vitro" pure?

Un des partenaires possède une animalerie, mais je ne sais pas si le jeu en vaut la chandelle si on peut faire autrement ; dans le meilleur cas, on a quand même besoin d'une souris brainbow gestante et ça je sais même pas si on peut les commander surtout en europe. Je pense, et dites moi si je me trompe, que Jackson vend des souris à des labos qui vont ensuite maintenir les lignées acquises.

Ou effectivement comme je pense que tu voulais dire "in vitro" pure, tu parlais de transfecter le construct brainbow aussi dans des neurones normaux ? ... Oui pourquoi pas, mais il faut que la transfection soit très efficace, qu'il y ait intégration et de toute façon après il faudrait en plus la Cre donc je sais pas si c'est le plus facile. Je vais voir s'il est possible d'avoir les lignées qu'on veut là ou je vais travailler.

Merci

[nowell]

Je pense effectivement qu'il voulait dire in vitro, j'ai aussi sauté au plafond^^... Le problème étant qu'un transfection ou une infection ne seront jamais à 100%. La nucléofection par système AMAXA donne d'excellents résultats surtout avec leur nouveau système le Kit.V.
L'infection intégrative vous butera en plus des cellules de par l'intégration aléatoire, pour peu que cela coupe un gène essentiel.

Je reviens à votre microfluidique, c'est génial, j'en fais aussi!! Mais là où je suis sceptique à fond les ballons, c'est de pouvoir créer un substrat 2D de PLL par exemple (ou quoi que ce soit) dans la goutte. Les chimistes avec lesquels je collabore me disent possible de coater la face interne des bulles, notamment sur la partie interne des surfactants pour maintenir un genre de raft moléculaire permettant à la cellule de se différencier et de maintenir un phénotype donner. Vous faites de ce genre de chose ? ou alors ajouter simplement de la PLL polymérisée dans le milieu de culture de la bulle ?

Cordialement

[wolfgangouille]

Bon apparemment on pourrait peut être avoir ces souris à l'animalerie donc après on peut faire ce qu'on veut faut juste demander.

Pour la microflu, en fait on n'a pas de bulles ou de gouttes, le PDMS ou le verre est patterné, et les neurones sont introduit dans le système et s'accroche sur les patterns, puis poussent selon les contraintes méchano-chimiques.