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séquençage d'une proteine




  1. #1
    beam86

    séquençage d'une proteine

    Bonsoir,

    j'aurais une question à vous poser et j'espère que quelqu’un connaisse la réponse parce que j'ai beau cherché sur internet mais j'ai rein trouvé!!

    voila dans l'article les auteurs ont procéder à une digestion enzymatique d'une protéine par la trypsine et par la Asp N. Ensuite ils ont fait une analyse des peptides par HPLC couplé à un spectromètre de masse en tandem. Ce que j'ai pas compris c'est comment en premier temps on identifie les acides aminé sur le profil d'élution de HPLC et comment on determine l'ordre de chaque acide aminé? cad comment savoir que c'est une tyrosine et non une lysine ou cysteine? et comment on détermine qu'il ya une tyrosine ensuite une methionine ensuite une leucine dans notre peptide?
    Et en deuxième temps comment on determine l'odre des différents peptides constituants la proteine?
    Une dernière question: au niveau de la HPLC la séparation des peptides se fait comment? Je c que c'est en fonction de l'hydrophilie mais je comprends pas comment ça se passe quand il s'agit de peptides? est ce que lors de l'élution ya séparation des AA par rupture de leur liaisons peptidiques pour qu'ils puissent apparaitre un par un ? La séparation se fait peptide par peptides??

    j'ai besoin de votre aide je me trouve dans une impasse merci d'avance

    -----


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  3. #2
    mmm91

    Re : séquençage d'une proteine

    Bonsoir,

    Attention : la HPLC est une technique de séparation qui dépend de la colonne que tu utilises ! Tu peux faire une HPLC avec une colonne de chromato d'exclusion, d'affinité, à échanges d'ions etc.
    Il faut donc que tu nous précises cela... Car l'ordre d'élution de tes peptides ou acides aminés dépendra de ce type de colonne.

  4. #3
    beam86

    Re : séquençage d'une proteine

    c'est une HPLC en phase inverse c'est tt ce qui est écrit et que la colonne est de diamètre 100µmX150mm entourée de Ultro120 C18
    voila l'extrait de l'article:
    "The peptides were fractionated by reversed phase high pressure liquid chromatography using an Eksigent one-dimensional NanoLC system (Dublin, CA). The column was a 100-μm-inner diameter × 150-mm self-packed column with Ultro120 (Peeke Scientific, Redwood City, CA) C18 resin. The flow rate was 350 nl/min; solvents were water, 0.1% formic acid (A) and acetonitrile, 0.1% formic acid (B); and the gradient was 5–30% B over 40 min"


  5. #4
    beam86

    Re : séquençage d'une proteine

    personne ne connait la réponse à ma question c'est vrai que c difficile et compliquée comme question!! mais j'attends toujours votre aide!!

  6. #5
    Gordak

    Re : séquençage d'une proteine

    Salut,
    Je vais essayer de te décrire ce qui se fait généralement lors de l'étude de protéine par spectrométrie de masse.

    D'abord, la technique utilisée dépendra grandement de ce que tu veux faire. S'agit-il de l'identification d'une protéine inconnue que tu as réussi à purifier, d'un mélange complexe de protéines, de l'étude des modifications post-translationelles ? Bref, il existe beaucoup d'applications à cette technique, et à chaque application, tu choisiras d'appliquer certains paramètres et tu devras faire des choix.

    Ici, je suppose qu'il s'agit de l'identification d'une protéine. Donc, pour commencer, ils digèrent la protéine avec différentes protéases, ce qui génère plusieurs peptides. Ces peptides sont ensuites séparés par HPLC, où la colonne est couverte de chaînes de carbone (C18 ici). L'élution se fait grâce à une solution (citée dans l'article) de plus en plus concentrée, ce qui provoque une élution séquentielle de tes peptides (vu que chaque peptide aura une affinité différente). Les peptides sont ensuite ionisés par electrospray à l'entrée du spectromètre de masse.

    Une fois dedans, l'analyse peut se faire en plusieurs étapes. Lors de la prémière étape, chaque population de peptides sera analysée selon le même schéma. D'abord, les peptides sont piégés dans linear trap, où ils seront fragmentés. Les fragments sont ensuite analysés (leur ratio masse/charge) par ce linear trap. Les fragments les plus fréquents vont être retenus pour une seconde analyse.

    Lors de la deuxième étape, un nouvel échantillons de peptides rentre dans le mass spectrometer et reste piégé dans le linear trap. Cette fois, ils sont fragmentés ( comme avant), mais les fragments ne sont pas analysés par le linear trap, au lieu de cela, certains sont sélectionnés (les plus fréquents - ou les plus grands "pics"), tous les autres sont "jettés". Les fragments sélectionnés sont envoyés dans un orbitrap. L'orbitrap va analyser ces fragments et déterminer leur m/z en fonction de leur fréquence de résonnance de vibration, qui se retrouve à partir de la transformée de Fourier (du courant induit dans une antenne par le champ magnétique variable des fragments, je suppose).

    Une fois le ratio m/z de chaque fragment déterminé, commence une phase de recherche dans des basees de données. Chaque bases de données contient des milliers de protéines. Ces protéines vont être virtuellement "modifiées" selon le protocole que tu as utilisé (tu dois donc spécifier chaque transformration que ta protéine a subie, par exemple, quelles protéases tu utilises, si ta protéine est phosphorylée, combien de mutation tu peux admettre, etc...). A partir de cela, le moteur de recherche compares les résultats de ton analyze avec les résutats théoriques pour chaque protéine (ce qui prend du temps). Si les résultats de ton analyse et les résusltats théoriques coïncident pour tous les fragments, alors ton peptide provient de cette protéine. Si ton peptide ne peut pas être associé à une protéine unique, ce n'est pas grave, tu as toujours les autres peptides dans ta HPLC qui doivent être analysés.

    Si tu veux séquencer entiérement ta protéine (disons qu'elle n'apparait pas dans ta base de données). Tu peux utiliser la méthode D'Edman, analyser plus de fragments ou utiliser plus d'endoprotéases.

    J'espère que ça t'as éclairci un peu la situation.

    Gordak

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    beam86

    Re : séquençage d'une proteine

    Merci beaucoup Gordak pour ta réponse mais ma question est par rapport à la HPLC étape préalable avant la spectrométrie de masse!!
    en fait g pas compris comment se fait l'identification des acides aminés par HPLC ?
    dans la solution a analyser ya bien plusieurs peptides, est ce que la liaison peptidique entre les AA d'un meme peptide est rompu et c'est ce qui fait qu'on observe ensuite sur le profil d'élution chaque AA représenté par un pic?
    Comment détermine on l'ordre des acides aminés d'un peptide? Qui se trouve avant qui dans le peptide? et comment ensuite determine on l'ordre des peptides qui constituent la protéine? Quel est le premier peptides quel est le 2ème etc??

  9. #7
    Gordak

    Re : séquençage d'une proteine

    D'accord.
    La HPLC ne permet pas d'identifier les acides aminés, elle n'est utilisée que pour séparer les peptides. La protéine est digérée en plusieurs peptides, ces peptides sont séparés par la HPLC. Les peptides ne sont pas fragmentés durant la HPLC, il n'y pas pas de liaisons covalentes qui sont cassés entre les a.a. La seule utlité de la HPLC, c'est de pouvoir analyser les peptides de façon séparée avec le spectromètre de masse. Car si tu analyse tous les peptides en même temps, ton spectre obtenu serait beaucoup trop complexe.

    Chaque peptide (généré par une ou plusieurs endoprotéases différentes) est donc analysé séparément. Pour chaque peptide, tu peux le fragmenter. Cette fragmentation se fait en appliquant des voltages alternatifs aux borns du linear trap. Ceci permet de créer des collisions entre les peptides. Les peptides finissent par se fragmenter en petits fragments. Les liaisons qui cassent sont typiquement des liaisons entre les acides aminés. Tu peux voir un schéma qui t'explique où surviennent ces cassures. Ensuite, tous les fragments générés à partir d'un peptide sont analysés (leur masse est mesurée). Vu que l'on connait la masse de chaque acide aminé, il est ensuite possible de savoir quelle est la composition de chaque fragment. Si on assemble ensuite chacun de ces fragments, on peut retrouver la séquence du peptide avant sa fragmentation. On pourra ainsi connaitre la séquence de chaque peptide. De cette façon, on ne séquence pas de façon séquentielle (acide aminé par acide aminé). Le séquençage n'est possible que si la fragmentation génère assez de fragments différents.

    Bien sûr, il faudra faire ceci avec au moins deux endopeptidase, et analyser tous les peptides de cette façon. Pour pouvoir ensuite assembler les séquences de tes peptides pour connaitre la séquence entière de ta protéine.

    Ensuite, il est possible de séquencer ta protéine de façon séquentielle grâce à la méthode d'Edman que j'ai citée avant. Cette méthode va dégrader ta protéine acide aminé par acide aminé. Le produit de la dégradation est analysé et tu peux ainsi déterminer ta séquence d'acides aminés.

    J'espère que c'est plus compréhensible

    Gordak

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  11. #8
    beam86

    Re : séquençage d'une proteine

    ok donc la HPLC sert à séparer les peptides un par un et il passe après au MS pour etre identifier et pour déterminer d’éventuelles modifications post traductionnelles!!!
    j'avais poser cette question et personne ne ma répondu!!

    qd on fait une digestion enzymatique d'une protéines par la trypsine par exemple est ce que après on fait une électrophorèse des différents peptides? est ce qu'on extrait la bande correspondant à un peptide donné du gel et ensuite on procède à la HPLC? si oui comment se fait cette extraction?
    et une dernière question est ce que l'analyse en HPLC se fait peptides par peptides extrait du gel? ou bien c'est tout le mélange issu de la digestion enzymatique qui passe à l'analyse en HPLC??

    merci pour ton aide Gordak

  12. #9
    Gordak

    Re : séquençage d'une proteine

    On peut en effet fait une électrophorèse avant l'HPLC. Par contre, je ne sais malheureusement pas comment se fait l'extraction.

    En fait, d'un point de vue général, on veut analyser des peptides les plus pures possible à la MS. Car plus l'échantillon est complexe, plus le signal (spectre) est compliqué et difficile à analyser. Lors de l'analyse de solution complexe (par exemple, une protéome entier), il est indispensable de séparer les protéines le plus possible avant de procéder à l'analyse. On évitera donc de faire une digestion de plusieurs protéines suivi d'une technique de séparation.

    Pour résumé, on fera plutôt les choses dans cet ordre: séparation --> digestion --> HPLC --> MS

    Bien sûr, on aura pas toujours cette possibilité, dans le cas de l'analyse de tout un protéome, je crois que la digestion n'est pas possible, car il est impossible d'avoir une séparation complète des protéines entre elles (à confirmer)

    Gordak

  13. #10
    beam86

    Re : séquençage d'une proteine

    Merci encore une fois

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