Signal de western-blot plus fort a 1 minute que sur la nuit

[Enialix]

Bonjour a tous,

J'ai récemment eu des problèmes de western-blot.
Mes échantillons contrôles, qui me donnent un très fort signal après 1 seconde d'exposition d'habitude, n'ont plus donné signe de vie.
J'ai tenté de charger un peu plus mon gel, et j'ai eu un faible signal au bout d'une minute. Ceci étant mes échantillons contrôles, je ne voyait pas encore mes échantillons a analyser, j'ai donc laissé sur la nuit.
Je développement ce matin, et il n'y a rien sur le film, même plus mes contrôles, alors que d'habitude sur la nuit j'obtient des bonnes grosses patates.
Je développe avec une machine qui doit avoir dans les 20 ans au bas mot, pensez vous que cela peu provenir de ça? J'ai vérifié le niveau de révélateur, ça semble OK.
Je relance des manips, et je ne voudrais pas faire tout ça pour rien.
Si quelqu'un a une idée d'ou le problème pourrait provenir, ou de ce que je pourrais faire pour vérifier certains paramètres, je suis preneur.

Merci d'avance,
Enialix.
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[invite87c7b6fa]

Bonsoir,

Je ne suis pas vraiment un expert, mais juste au petit jeu de "je remets en cause logiquement chaque étape"

Avez- vous changé un paramètre lors de ce WB par rapport aux autres??
quelques exemples :
-Lot d'anticorps primaire/secondaire
-membrane du blot
-tampon de lavage
etc

Si il y avait un signal au bout d'une minute et qu'il a disparu après 20h, c'est que qqchose du sandwich c'est dégradé...

Gunkan

[Enialix]

Merci de ta réponse,

J'ai en effet change de lot d'anticorps primaire, et je suis actuellement en train de reprober ma membrane. Cela m’étonne quand même que ce soit ça, car j'aurai du avoir un signal sur la nuit puisque j'en ai eu un en 1 min.
Je ne pense pas que ce soit une dégradation, car j'ai exposé 1 min, mis mon film dans la machine, et remis un film tout de suite pour la nuit, j'aurai donc du avoir au moins le même signal que pour 1 min (a moins que toutes mes protéines se soient dégradées dans les premières secondes mais j'en doute).

Je verrai déjà avec mon ancien lot d'anticorps ce que ça donne, mais je n'exclu pas un problème de révélateur dans la machine (la semaine dernière elle a bouffé tout mes films, ils étaient irrécupérables ^^)

[inviteb3a6feac]

Bonsoir

Mon post ne va servir à rien, mais c'est une preuve supplémentaire que tous les assays qui se terminent en "blot" en bio sont de la merde^^.
ça marche quand ça veut bien^^.

Nowell

[A voir en vidéo sur Futura]

[Enialix]

Le résultat avec l'ancien anticorps n'a rien donné.
J'ai tenté d'illuminer le film avec les aiguilles de ma montre avant de le mettre dans la machine (non je ne suis pas Mac Gyver ^^, mais je fais comme ça de temps en temps pour voir si tout va bien), et je n'ai eu qu'un très très faible signal au bout de 2 secondes alors que d'habitude ça me donne une grosse patate.
Un collègue m'a donne un petit autocollant phosphorescent a coller dans la cassette pour vérifier ça plus scientifiquement ^^, j'aurai la réponse dans 45 minutes.

[Enialix]

Toujours rien sur mon film, mais la machine semble fonctionner correctement (merci l'autocollant). Je soupçonne donc maintenant en premier lieu mon ECL, puis l'anticorps secondaire.