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Western Blot Transfert sur membrane



  1. #1
    Charlotte24450

    Western Blot Transfert sur membrane

    Bonjour,
    est ce que une personne peut m'aider.
    Je dois faire des western blot sur proteine petit PM (20kDA), mais avant mon maitre de stage veut que j'optimise les conditions donc je fais juste des western avec la beta actine, et le transfert sur membrane ne marche jamais ! J'ai essayé 1h 100V (je mets 3 membranes pour vérifier) j'avais des bandes bleues sur les 3 membranes et encore des protéines sur mon gel, 2h 50V, pareil ! . Je sais plus quoi faire !

    -----


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  3. #2
    TanguyE

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Bonjour,

    Tout d'abord il faudrait que tu nous dise quel type de transfert tu fait: liquide (tout est immergé dans le tampon de transfert) ou semi sec (les éléments composant le sandwich sont juste imbibés de tampon de transfert).

    Ensuite si tu as besoin que la totalité de ton échantillon soit transféré ou non.

    J'ai pas bien compris ce que tu fais avec les 3 membranes, tu les mets à la suite les unes de autres sur ton sandwich?

    Cordialement

  4. #3
    Charlotte24450

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Alors pour ma part tout est immergé dans le tampon de transfert !
    Oui je souhaite que tout mon échantillon transfert, enfin je travaille que sur Gadd45, Bax, Bcl2 donc petits poids moléculaire donc je voudrais au moins que les petits PM soient transférés les gros PM c'est moins important pour moi .

    Oui c'est ça je mets 3 membranes les unes sur les autres...et là j'ai des bandes bleues sur les 3 (les bandes de fin de migration) mais qd je les mets dans le rouge pinceau je vois aucune bande donc pas de transfert de protéine ?? Ou un over transfert ??
    Est il possible que je vois les bandes bleues (car bandes de fin de migration grosse concentration de bleu de commassie ...je sais pas...) mais que les protéines n'ont pas transférées ?

    Je suis un peu perdue en faite je me demande si rien à transféré ou tout !

  5. #4
    TanguyE

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Ok

    Alors le bleu que tu vois en bas, c'est pas du bleu de coomassie mais du tampon de charge qui entraine ton échantillon au fond du puits.

    Généralement, mes transfert liquides, je les fait à 30V pendant 1h30/2H ou à 10V sur la nuit dans des cuves X-cell II de chez invitrogen.

    Le moyen le plus simple de voir si tu as transféré quelque chose, c'est de contrôler que ton marqueur de poids moléculaire ait bien été transféré sur ta membrane. Si il n'est pas sur la membrane, c'est que tu n'as rien transféré.

  6. #5
    Charlotte24450

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    ok,

    alors oui mon marqueur est bien présent sur la 1ère membrane mais pas sur les autres.
    La présence du tampon de charge sur mes 3 membranes ne signifie pas forcement que mes protéines ont transféré sur les 3 membranes non ?
    Je suis sencée récupérer les membranes 2 et 3 blanche comme neige ?

    Merci pour votre aide, pcq je suis en stage à Vancouver, et je tente bien de poser des questions à mon maitre de stage, mais déjà il me laisse pas bcp parler et en anglais en + .... !

    Bonne soirée

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    TanguyE

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Oui tu es censée récupérer les membrane 2 et 3 blanches mis à part des traces de tampon de charge.

    Si ton marqueur est transféré, c'est que le transfert fonctionne. Quelle quantité de B-actine déposes tu à migrer? Parce que le rouge ponceau a une limite de détection de 250ng et il ne fonctionne pas terrible avec les membranes en PVDF.

    Tu peux aussi essayer de diminuer le voltage, sans augmenter le temps de transfert pour être sure que tes protéines de bas PM diffusent dans le tampon.

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  10. #7
    TanguyE

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Oui tu es censée récupérer les membrane 2 et 3 blanches mis à part des traces de tampon de charge.

    Si ton marqueur est transféré, c'est que le transfert fonctionne. Quelle quantité de B-actine déposes tu à migrer? Parce que le rouge ponceau a une limite de détection de 250ng et il ne fonctionne pas terrible avec les membranes en PVDF.

    Tu peux aussi essayer de diminuer le voltage, sans augmenter le temps de transfert pour être sure que tes protéines de bas PM ne diffusent pas dans le tampon.

  11. #8
    Charlotte24450

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Ha ben c'est peut être juste des traces de tampon de charge et pas un over transfert ... mais bon j'y crois moyen ! Je révèle ma membrane demain après passage à l'anticorps secondaire . La dernière fois j'avais rien .
    Je mets 50 ug de protéine/ puit !

    Jvais peut être essayer 30V...

    Merci !

  12. #9
    Flyingbike

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Ca doit pas être un problème de over transfert. Si tu as bien des protéines dans ton gel, il ne devrait pas y avoir de problème tant que la composition du tampon est bonne, qu'il y a suffisamment de jus et que ça transfère suffisamment longtemps.

    Tu as essayé de colorer le gel avant transfert (au coomassie) ?

    100V ca te fait quelle intensité (en mA) ?

  13. #10
    Charlotte24450

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Bonjour, c'est encore moi, et j'ai toujours pas réussi à optimiser mon western blot, j'ai tout tenté, même de changer d'appareil pour le transfert sur membrane ...
    Mon problème en ce moment c'est qu'après le transfert sur membrane mes bandes de protéine sont "coulantes" comme si on les avait frottés tout comme les bandes du marqueur de poids moléculaire...
    Auriez vous une idée de la source du problème ?
    Merci

  14. #11
    TanguyE

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Bonjour,

    Je pencherai pour un souci lors de la migration sur gel. Comment se présente ton front de migration, est-il rectiligne ou tu voit déjà des coulures?

    Tes gels sont faits maison ou tu les achètes pré-coulés? Si ils sont fait maison, il arrive que l'acrylamide polymérise moins bien en fonction des conditions de chaleur et d'humidité. Si ils sont pré-coulé, ça peut être un problème de lot, où il faut les faire migrer à vide pour les nettoyer un peu avant de déposer tes échantillons.

  15. #12
    Charlotte24450

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Mes gels sont fait maison !
    Mais quand je passe mes gels au bleu de coomassie après le transfert sur membrane il n'y a pas de trainées les bandes sont nettes c'est pourquoi j'en ai déduit que ça venait du transfert sur membrane...

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  17. #13
    TanguyE

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Je vois pas trop ce qui pourrait poser souci dans le transfert mais voici les points que tu peux vérifier:

    - Présence de bulles d'air entre le gel et la membrane lors de la préparation du sandwich. Il se peut aussi que ton sandwich ne soit pas assez compressé lors du transfert (tu peux rajouter des éponges pour palier ce problème)
    - Problème avec ton tampon de transfert
    - Membrane pas suffisamment activée dans l'éthanol avant le transfert


    C'est tout ce qui me vient à l'esprit pour le moment.
    -

  18. #14
    Charlotte24450

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    ok merci je vais déjà vérifier ces points, j'active ma membrane 15 sec dans du methanol puis qq'secondes dans l'eau puis qq'minutes dans le tampon de transfert...

  19. #15
    Flyingbike

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    c'est quoi comme support ? du nitrocellulose ou pvdf ?

  20. #16
    Charlotte24450

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    c'est du pvdf

  21. #17
    Gcy

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Salut,

    es ce que tu pourrais nous donner la composition de ton tampon de transfert ? meme si je doute que le problème vienne de la étant donnée que le marqueur "passe bien"....

    Au labo on fixe plus l’ampérage que le voltage (en gros en général on a 40V 120mA pendant 1h/2h)...

    Es tu sur de ton dosage de protéines ?

    as tu essayer sur nitrocellulose?

  22. #18
    Charlotte24450

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Je pense que ça peut venir du moment où je fais mon sandwich car j'immerge tout dans le tampon de transfert alors que j'ai vu une video où il immerge que l'éponge et fait son sandwich dessus ainsi peut être que le gel at la membrane adhère mieux ...
    Tampon de transfert:
    -3.03g de Tris Base
    -14.4g de Glycine
    -200mL de méthanol
    + eau jusqu'à 1L
    Quelle influence a mon dosage de protéine sur ce problème ?

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  24. #19
    Charlotte24450

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Et aussi ça change quoi d'utiliser une membrane nitrocellulose ou PVDF ?

  25. #20
    TanguyE

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    En effet, il y a des chances que ce soit lors de l'assemblage de ton sandwich que des bulles se forment.

    Moi ce que je fait, c'est mettre un fond de tampon de transfert dans un plateau, immerger mes éponges et mes papiers Whattman afin qu'ils soient gorgés de tampon et ensuite je forme mon sandwich hors du liquide (en général sur une des éponges qui dépasse du niveau de tampon). Enfin pour bien chasser les bulles, je roule un morceau de pipette sur mon assemblage éponge-whattman-gel-membrane-whattman avant de placer la dernière éponge et de mettre le tout dans la cuve.

    La seule différence que je connaisse entre la nitrocellulose et le PVDF, c'est que les membranes en nitrocellulose sont plus fragiles et supportent moins bien les étapes de stripping. Perso, je n'ai jamais utilisé de nitrocellulose.

    ps: il me semble qu'on utilise pas du tout de méthanol au labo, on l'a remplacé par de l'ethanol 100% qui est bien moins toxique.

  26. #21
    Charlotte24450

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Merci bcp pour ces réponses je vous tiens au courant !

  27. #22
    Charlotte24450

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Bonjour,
    mes WB marchent enfin, je me pose alors de nouvelles questions, je souhaite révéler ma target proteine puis ensuite révéler l'actine sur la même membrane pour vérifier ma quantité de protéine.
    Ma première révélation pour mes targets proteines utilise des Ac rabbit (ou mouse) et après je voudrais sur chacune de mes membranes faire une révélation d'actine, l'Ac Actine est goat. Goat étant diff de mouse ou rabbit suis je obliger de stripper ma membrane avant d'incuber avec l'Ac 1st d'actine ? Quel protocole me conseillez vous ?
    Merci pour votre aide !

    Charlotte

  28. #23
    TanguyE

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Bonjour,

    Si ta protéine d'intérêt a un PM différent de celui de l'actine et que cette différence est d'au moins 10kD, tu n'auras aucun problème a mélanger tes deux anticorps primaires pour la première incubation. Après il faut que tu regarde sur les docs de tes secondaires si le anti-mouse/rabbit ne cross-réagit pas avec du goat et si ton anti-goat ne cross-réagit pas avec du mouse/rabbit. Si ni l'un, ni l'autre ne cross-réagissent, tu pourra aussi les mélanger pour ta seconde incubation.

  29. #24
    Charlotte24450

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Je préfère faire séparemment même si mes protéines ont + de 10kD de differénce (enfin c'est mon maître de stage qui veut pas que je mélange mais il me donne aucune autre solution).
    Donc je vais d'abord révéler ma target protéine après celà je pensais rincer ma membrane dans du PBS rebloquer 1h et mettre l'Ac 1st Actine overnight
    Pensez vous que c'est un bon protocole ? Le "re blocage" est il necessaire ?
    Merci

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  31. #25
    Charlotte24450

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    Mon protocole a marché !
    J'ai une nouvelle question concernant l'analyse des résultats;
    Comment ajuster mes résultats avec mes valeurs de Beta actine ?
    Par exemple:

    Intensité Sample A= 0,98 sample B =1,3 C =1,8
    Si ma beta actine me donne sample
    A 1,7 et sample B 0,2 C 1,5 (mauvais résultats mais c'est un exemple)
    je fais
    Sample A: 0,98/1,7
    B: 1,3/0,2
    C:1,8/1,5
    ce qui de donne A : 0,57 et B : 6,5 et C: 1,2
    Moi je souhaite reprendre mes valeurs d'intensité de sample pour faire des ANOVA dessus donc si je veux "corriger" mes valeurs suite aux resultats obtenus avec la beta actine est ce que je dois faire comme suit:
    Ratio A: 0,57
    Ratio B: 6,5
    Ratio C: 1,2
    Après je fais des ratios entre ratio par rapport au + haut ratio (ici le ratio B)
    Ratio B/A= 6,5/O,57=11,4
    Ratio B/C= 6,5/1,2=5,41
    Donc pour corriger mes résultats d'intensités je fais
    A= 0,98*11,4
    B=1,3
    C=1,8*5,41

    et j'ai des nouvelles intensités de sample corrigés par mes valeurs de beta actine ... Pensez vous que ma méthode est bonne "mathématiquement" ??
    Merci pour votre aide !
    A bientôt

  32. #26
    Charlotte24450

    Re : Western Blot Transfert sur membrane

    ou alors je prends juste les Ratios
    Ratio A: 0,57
    Ratio B: 6,5
    Ratio C: 1,2
    Et je fais mon anova dessus comme si c'était mes valeurs d'intensité ?

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