Sous-clonage et taille des fragments

[invitedf2380ee]

Bonjour,

je sollicite votre aide pour résoudre mon problème. Suite à un sous clonage, mon insert d'intérêt (environ 0.42kb) à été intégré dans un vecteur (3.6kb)... soit une taille totale après sous clonage de 4.02Kb. Après test de différentes colonies (9 en tout) et digestion de mes plasmides (double digestion enzymatique: XhoI / NcoI)...le résultat sur gel donne ceci:





La taille des poids moléculaires donnent de haut en bas: 10Kb, 8, 6, 4, 3, 2.5, 2, 1.5, 1 et 0.5Kb.

Observation et problème:

Mon fragment d"intérêt de 0.42Kb est présent pour les conditions n°2 - 5 - 6 et 9...mais la taille du vecteur ne corresponds pas (il fait entre 2 et 2.5Kb au lieu de 3.6Kb).
Or, les autres conditions ne possèdent pas mon insert, mais ont la taille du vecteur OK.

Comment cela se fait-il que les conditions contenant l'insert est un vecteur de taille inférieure à celui de départ?
Est ce que le sous-clonage est réussi ou non?

Merci d'avance pour vos éléments de réponse!

Cordialement.
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[invitec0b62935]

Tu indiques 10 bandes dans le marqueur mais j'en compte 11 sur le gel, c'est donc possible que toutes tes estimations de taille soient décalées.

[invitec0b62935]

Envoie le clone 1 et le clone 2 au séquençage, ça te coutera moins cher que de refaire des essais de digestion et le résultat sera sans ambiguité.

[invitedf2380ee]

Merci pour vos réponses!

Alors effectivement, j'ai oublié de glisser une taille pour les poids de marqueurs moléculaires, il manque le 5Kb au milieu. Il y a donc bien 11 bandes. Ce qui ne change pas le problème au final.

Effectivement, je pourrai envoyer ces clones au séqençage... mais cela ne me permets pas de comprendre ce qui s'est passé...

En tout cas merci pour les réponses...s'il y a d'autres avis sur le sujet ou des personnes à qui cela est arrivé, n'hésitez pas!!!

[A voir en vidéo sur Futura]