Bonjour,
Je suis nouveau sur ce forum et content de l'avoir intégré. J'ai appris beaucoup de choses depuis.
J'ai fait des ligations de différents inserts de tailles 900bp, 1400bp et 1900bp avec du pET45b. Les inserts sont obtenus d'un sous-clonage dans du pGEM-T Easy vector,par double digestion BamHI/NotI puis purification sur gel (contenat 1goutte de BET pour 100ml). Le vecteur a été ouvert avec les mêmes enzymes. Les ligations se sont faites en respectant l'equimolarité c-a-d 1M de vecteur pour 3M d'insert.
J'ai laissé la ligation se faire O/N à 4°C. Ce matin j'ai verifié les ligations sur gel, j'obtient des "smears" pour toutes mes ligations y compris la ligation témoin (vecteur ouvert sans insert).
Questions: Le fait d'obtenir des smears est une confirmation que les ligations ont fonctionnées?
Si oui, les ligations étant effective, on sait qu'un sert peut intégrer plus de 1plasmide à la fois. Comment selectionner par après, les clones n'ayant intégré qu'un seul insert? Doit on faire une PCR de colonies de tout les clones obtenus jusqu'à ce qu'on ait le bon clone?
Cordialement!
pGEM-T
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