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Phosphorylation in vitro



  1. #1
    lashwar

    Phosphorylation in vitro


    ------

    Bonjour à tous.
    J'aurais quelques questions concernant une manip que j'aimerais faire.
    On aimerait savoir si une tyrosine kinase phosphoryle bien notre proteine, on a déjà des résultats qui le suggèrent notamment avec l'utilisation d'inhibiteur et des tests fonctionnels - la proteine cible est un canal ionique - mais on voudrait une preuve plus direct et pourquoi pas trouver les sites de phosphorylation.

    Le plan est de tester la phosphorylation in vitro puis de faire un western blot utilisant un AC anti-phosphotyrosine... par la suite à la place du western blot on voudrait envoyer nos échantillons phosphorylés en spectrométrie de masse.

    Du coup nous pensions faire une immunoprecipitation de notre prot avant la phopshorylation. Mais dans ce cas faut il laisser les prot sur les billes ou doit t on les detacher avant?
    Pensez vous que ce genre de manip peut être fait avec de l'ATP non marqué (pas de radioactivité en ce moment dans le lab plus manip faites avec un étudiant n'ayant pas les autorisations!) et que la phosphorylation sera tout de même bien détectée par immunodetection?

    Est ce que quelqu'un aurait des conseils sur une telle manip (genre quelle quantité de protéine faut il avoir etc)?

    Merci d'avance...

    -----

  2. #2
    lashwar

    Re : Phosphorylation in vitro

    Bjr... héhéhé 1 an après toujours pas de réponse...
    Dommage, après avoir laissé un peu tomber les phosphorylations je me replonge dedans.
    du coup ma question reste la même, pensez vous qu'il soit possible d'utiliser un protocole de phosphorylation in vitro et de remplacer l'ATPp32 par de l'ATP normal puis d'envoyer mes échantillons en M/S?
    Merci...

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