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problèmes de PCR , à l' aide!!!



  1. #1
    synops

    problèmes de PCR , à l' aide!!!

    salut,

    voila j'ai des ennuis avec mes extraits d' adn d' insecte. après PCR l'électrophorèse sur gel ne montre aucune bande.j'ai quantifié au spectrophotomètre et la quantité d' adn varie de 10 à 30 nanogrammes/µl, le rapport 260/280 est bonne pour la plupart, mais ne donnent pas de résultat après PCR;
    si cela se trouve, est-il possible qu'il y ait des inhibiteurs, et comment les purifier?
    merci de votre aide


    -----


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  3. #2
    Flyingbike

    Re : problèmes de PCR , à l' aide!!!

    10 à 30ng /µL ne se voit pas nécessairement sur gel. En tout cas si la PCR avait fonctionné vous devriez avoir beaucoup plus que ça. Etes vous sur de vos amorces ? de la composition du mix ? du programme ? de la qualité des ADN de départ ?

  4. #3
    synops

    Re : problèmes de PCR , à l' aide!!!

    salut,
    merci de ta réponse, mais cette quantité c'est la quantité d' adn mesurée AVANT le PCR.

  5. #4
    Flyingbike

    Re : problèmes de PCR , à l' aide!!!

    faudra nous donner plus de détails (cf ma réponse plus au dessus) parce que la PCR c'est plutôt complexe a debugger

  6. #5
    synops

    Re : problèmes de PCR , à l' aide!!!

    merci,

    mon extraction a été faite avec instagene matrix, je ne sais pas si vous en avez entendu parler. mon PCR des fois cela marche et des fois non,je veux dire les échantillons, pourtant le témoin positif marche toujours donc je pense que le problème viendrait de mes extraits d'ADN et de leur pureté.
    mais voila je ne suis plus sûre de rien maintenant.
    avez-vous entendu parler de kit de purification des extraits d'ADN, pour enlever d'éventuels inhibiteurs de PCR et d'augmenter la concentration? j'y pense beaucoup mais j'ai besoin de l'avis de gens comme vous qui connaissent le problème
    à plus.

  7. A voir en vidéo sur Futura
  8. #6
    Flyingbike

    Re : problèmes de PCR , à l' aide!!!

    et ce controle positif, il vient d'ou ? il a été préparé de la même façon ?

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  10. #7
    synops

    Re : problèmes de PCR , à l' aide!!!

    non, il ne l'est pas. pour tout dire je fais une mise au point d'une technique d'extraction sans broyage chez les puces. en gros, on laisse incuber chaque spécimen dans Instagene matrix à 56°C toute une nuit, on fait un boiling pendant 8min. on centrifuge et on récupère le surnageant pour le PCR, le culot est constitué de billes de chelex qui "capte" les inhibiteurs selon le protocole du fabriquant.
    l' amorce que j'utilise est une portion de gène Cytochrome oxydase de 710pb standard pour tous les invertébrés. je m'en sers pour vérifier la présence d'adn dans mes extraits. j'ai faits beaucoup d'essais avant de me lancer dans une série de 900 extractions avec cette méthode! alors après une série de PCR, une vingtaine d'échantillon sur 200 marche

    désespérée

  11. #8
    Flyingbike

    Re : problèmes de PCR , à l' aide!!!

    c'est peu

    Ca peut etre plein de choses, comme vous dites la qualité de la matrice (je ne connaissais pas ce produit pour extraire), mais peut etre aussi le programme (températures). D'ailleurs quel est le programme ?

    Vous pouvez essayer un kit de nettoyage ou une précipitation phénol/chloroforme en parallèle pour voir si cela fonctionne mieux après.

  12. #9
    synops

    Re : problèmes de PCR , à l' aide!!!

    salut, Flyingbike!!!
    merci d'avoir la patience de me répondre!
    après avoir poursuivi mes manips et changé de primer, qui est devenu ITS2 spécifique pou siphonaptera, certains extraits qui n'ont pas donné de résultats avec CO1 marchent!!!!
    donc, ce n'est peut être pas un problème de pureté d'ADN,pour certains je suppose.

    Est-il possible qu'une solution de primer peut se détériorer avec le temps même conservé à -20, après décongélation et recongélation?

    pour le programme PCR:
    94°C:5'
    35 cycles:-94°C:30"
    -55°C:45"
    -72°C:45"
    72°C:10'

    des fois aussi j'obtiens deux bandes pour un seul puits don la deuxième (qui ne doit pas exister normalement) est non spécifique. la vraie devrait se trouver à 710pb et la non spécifique se trouve à peu près soit à 200 ou 300pb.

    qu'est ce que cela signifie?


    à bientôt!

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