Designer des Primers

[invite0d3258c2]

Bonjour

Besoin de votre aide SVP!!!!!!!

Je fais des qRT-PCR et quand je fais ma courbe de standard avec de l'ADNc, ça marche très bien. Par contre quand je fais la courbe de standard avec de l'AND génomique, ça ne marche plus du tout. Jai des R values de l'ordre de 0,70. Le probleme c'est que mon boss veut que je fasse la courbe avec de l'AND génomique, je n'arrive pas vraiment à comprendre pourquoi. Quelqu'un peut-il m'aider?
Pourquoi utiliser de l'ADN génomique pour la courbe de standard, sachant que la RT-PCR se fera à partir de l'ADNc?
Aussi, je pensais redesigner mes primers. Dois-je designer des primers spécifiques à l'ADN génomique? Si oui, comment le spécifier dans Blast?
Quelles sont les paramètres à prendre en compte pour une optimisation de ces primers?
Je vous remercie par avance pour vos réponses.
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[invite2db69bfb]

Bonsoir,
et bien, honnêtement je ne vois pas l’intérêt de faire un qRT-PCR sur de l'ADN génomique. S'il veut, il peut simplement faire une PCR en temps réel (qPCR) sur de l'ADN génomique.
Donc soit c'est un troll, car l'ADN génomique est juste le contaminant le plus redouté lors des qRT-PCR, soit il faut lui demander ce qu'il a derrière la tête et son idée va peut être révolutionner la biologie (mais je n'y crois pas trop ).

Bonne soirée !

[invite0d3258c2]

Merci pour ta réponse Htu. C’est moi qui ai mal compris. La qPCR se fera quand sur de l'ADNc , mais il veut que la courbe de standard soit faite avec de l'ADN génomique. La question est: y a t-il une façon particulière pour designer les primers afin que ça marche aussi bien sur l'ADNc et l'ADN génomique?

Merci

[invite2db69bfb]

Je t'en prie, au final ça ne t'aide pas tant que ça. ^^'

Je ne suis pas en Labo donc je ne côtoie pas ses techniques tous les jours. Juste je ne pense pas que quelque chose de spécial soit à faire, si ce n'est le protocole normal : Mettre des concentrations décroissantes d'ADN génomique dans tes 9 puits (ou 10 je ne sais plus) pour faire ta courbe standard. Concentration connue bien entendu, qui te sert comme étalonnage.

J'espère que quelqu'un de plus qualifié passera dans le coin !! Je vais quand même regarder ce que je peux trouver.

Bonne soirée et bon weekend !

[A voir en vidéo sur Futura]