Marquage Dig en Klenow, concentration de réactifs

[inviteacd9329b]

Bonjour,

J'ai un peu de difficulté à calculer les quantités (volumes) de réactifs pour ma réaction Klenow afin de marquer mes sondes à la dig.
J'utilise une DIG-11-dUTP. Le protocole mentionne que pour de 10ng à 3ug d'ADN porter à un volume de 15 ul avec H2O, je dois y ajouter 2 ul de DIG/dNTP mixture qui doit être : 10X concentrated : 1mM dATP, 1mM dGTP, 1mM dCTP, 0,65 mM dTTP et 0,35 mM DIG-11-dUTP à pH 7.5.

La DIG-11-dUTP est conc. à 125 nmol (125 ul)
Les dNTP sont conc. à 25 umol (250 ul)

Un grand merci,
-----

[invitee4e79868]

Bonjour,

Une petite question :
Tes réactifs, c'est en quantité ou en concentration?
je veux dire par là, pour la DIG-11-dUTP, tu as 125 nmol dans 125 µl? Ou tu as une concentration de 125nM (nmol/L)? Dans le premier cas, pas de problème. Dans le second, tu as une concentration plus faible, donc il te faut concentrer la solution (ou en acheter une nouvelle)...

Si c'est dans le premier cas :
DIG-11-dUTP : 125nmol/125µl => 1nmol/µl => soit 1mM
dNTP : 25µmol/250µl => 100µmol/ml => soit 100mM

Il faut te fixer un volume final pour réaliser ta solution (20µl par exemple). Et après, tu utilises LA formule : Ci*Vi=Cf*Vf
Où Ci = concentration initiale de ton composé, Vi son volume initial (ce que tu veux savoir), Cf sa concentration finale (ce que tu désires avoir) et Vf le volume final (le volume dont tu as besoin pour ta réaction et un petit peu plus).

Je te laisse faire les calculs.

Petits conseils : les dNTP (et surtout la DIG) est sensible au cycle de congélation/décongélation (dégradation). Si tu as besoin de beaucoup de ce mix, je conseille d'en réaliser des aliquots à volume utile (le nombre de condition effectué "normalement" + 1/2 - si généralement 5 conditions de 2µl => aliquot de 11µl).

[inviteacd9329b]

Merci pour la réponse :
Donc après calculs :

Dig-11-dUTP : 7,8ul pour un volume final de 22 ul
dATP/GTP/CTP : 0,2 ul pour un volume finale de 22 ul
dTTP : 0,14 (0,1 ul) pour un volume finale de 22 ul

[invitee4e79868]

De rien
Je suis d'accord avec tes calculs.
Pour avoir garder la précision (surtout pour le dTTP), pense à la dilution (1/10 par exemple), puis congélation (en aliquot) pour ne pas perdre ce précieux composé

[A voir en vidéo sur Futura]