Problème d'amplification lors d'une PCR

[invite83aee16e]

Bonsoir,
je suis étudiant en deuxième année de licence de Biologie-Biochimie. Lors d'un travaux pratiques, j'ai du réaliser une PCR semi-quantitative, afin d'amplifier d'un côté de l'ADN extrait d'hypophyse de souris KO-RFSH, et d'un autre côté de B-Actine.
Mes mixs sont les mêmes, excepté au niveau des volumes, pour les deux réactions.
Ils sont composés d'H2O, de Tampon, de MgCl2, des deux amorces (sens/antisens), de mes dNTP, et de Taq Polymérase.
J'ai lancé les deux PCR dans deux Thermo différents. J'ai effectué des extraits de 20µl des produits de PCR au 25ème, 30éme et 35ème cycle.
J'ai ensuite réalisé une électrophorèse sur gel d'agarose 2%.
Les réactions d'amplification/électrophorèse ont marché avec des mix identiques, les mêmes thermocycleurs et des extraits d'ADN semblables dans les autres groupes de TP toute la semaine d'avant.
Je poste ici les résultats de mon électrophorèse :
- sur la partie haute se trouvent les résultats pour la FSH -/-
- sur la partie basse se trouve la B-Actine.
- de gauche à droite, par groupe de trois, on lit les résultats d'ADN non dilué, dilué au 5ème et dilué au 25ème. Les trois premiers concernent le prélèvement au 25ème cycle, les trois suivants au 30ème cycle et les trois derniers au 35ème cycle. De même pour la B-Actine sur la partie basse.
Outre les résultats approximatifs pour la FSH, je ne comprends pas les résultats obtenus pour la B-Actine (sachant qu'ils ont été obtenu à plusieurs reprise dans mon groupe, mais pas dans les autres groupes).
Il n'y a pas de témoins négatif.
Ma chargée de TP me demande d'expliquer les résultats obtenus autrement que par des erreurs de pipetage ou des amorces/échantillons erronées.
En espérant que quelqu'un puisse m'aider.
Cordialement
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[invitec9f0f895]

Salut

Meme si c'est approximatif pour la FSH au moins il y a une ampli c'est déjà pas mal!
Par contre pour la b-actine, avant de pouvoir répondre, j'aimerai savoir si tu as fait les meme dépôts qu'au dessus? tu as prélevé à Trois temps de PCR différents?

Yoyo

[invite83aee16e]

Salut Yoyo,
Tout d'abord, merci de ta réponse. Oui ma FSH est acceptable dans l'idée. Pour la B-Actine, c'est exactement le même ordre, après les poids moléculaire, de gauche à droite , puit par puit :
- 25ème cycle, non dilué
- 25ème cycle, dilué au 1/5
- 25ème cycle, dilué au 1/25
- 30ème cycle, non dilué
- 30ème cycle, dilué au 1/5
- 30ème cycle, dilué au 1/25
- 35ème cycle, non dilué
- 35ème cycle, dilué au 1/5
- 35ème cycle dilué au 1/25.
Evidemment ce sont les extrait d'ADNc non-amplifiés qui sont dilué au départ et non pas les extraits de produits de PCR.
Ce que je ne parvient pas à expliquer c'est la détection de deux bandes d'intérêt au 25ème cycle suivie de leur disparition.
Julioo

[invitec9f0f895]

Salut

As tu envisagé la présence d'un inhibiteur de ta taq polymerase?

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite83aee16e]

@Yoyo
Dans ce cas comment expliquer la disparition de l'ADN ? Un inhibiteur, bloquerait la réaction et n'engendrait pas de catalyse inverse, non ?
Julio

[invitec9f0f895]

Salut

sur les échantillons assez dilués l'amplification a lieu, sur les plus concentré le produit inhibe la PCR.

YOyo