Bonjour cher tous,
J'ai récemment conçu des amorces pour amplifier des gènes dont j'ai envie d’étudier le polymorphisme. Seulement depuis une semaine j'y parvient pas, j'ai joué sur les températures d'hybridation en faisant une PCR gradient mais rien à faire. Avez vous des suggestions à me faire parvenir?
Merci pour votre aide!
quelle technologie ? PCR classique, PCRq, TaqMan ?
L'étape 1 du débogage de PCR est de vérifier les séquences.
Ensuite on réfléchit à son mix et à son programme.
Après on commence a invoquer les dieux de la PCR...
Bonjour.
Je suis d'accord que si rien ne fonctionne; c'est à dire que vous n'obtenez aucune bande, alors il faut commencer sérieusement à interroger les séquences et des amorces et de la cible. Il peut aussi y avoir une cause bétasse (rare mais qui m'est déjà arrivée), c'est la Taq qui ne fonctionne pas (plus); ou alors un dNTP qui n'est pas celui que vous croyez.
Mon approche était (je ne fais plus de PCR):
1. faire une bête PCR dans les conditions de design des amorces
2. faire un gradient de température pour optimiser les conditions, ou trouver une condition qui marche au moins un peu
3. si rien ne fonctionne, changer tous les réactifs
4. vérifier les séquences (il m'est aussi arrivé de recevoir un oligo mal conçu, qui ne fonctionnait évidemment pas. Il m'est également arrivé de découvrir une faute dans la séquence des bases de données; en fait, il m'est à peu près tout arrivé)
5. optimiser
Cordialement,
piwi
Je sers la science et c'est ma joie.... Il parait.
