Transfection plasmide gateway et faible expression proteique

[invite8135ca60]

Bonjour à tous,
J'essaye en ce moment de transfecter un plasmide pDEST40 (construit avec technologie gateway) et j'obtiens une expression proteique vraiment très faible.
Je sais que la transfection fonctionne bien puisque que je cotransfecte avec un vecteur pmaxGFP et que j'obtiens un taux de transfection très satisfaisant (essayé aussi avec un vecteur pEGFP-C1 et marche bien aussi!).
J'arrive à voir ma protéine en western blot mais avec un niveau très faible et tellement faible que je n'ai rien lors de mes tests fonctionnels (c'est un canal ionique).

Est ce que quelqu'un a déjà rencontré ce genre de problème, avez vous des idées/suggestions pour que je comprenne pourquoi et que je fixe ça?

Je veux transfecter des Hek293T, j'ai essayer différents kit d'extraction du plasmide, vérifié la sequence du vecteur et de ma protéine, verifié la concentration d'ADN, testé plusieurs concentrations... je ne sais pas quoi faire d'autre!

Merci d'avance
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[invitec9f0f895]

SAlut

Est-ce que tu es sur que ce n'est pas un probleme de repliement de ta protéine dans la membrane?
Les protéines membranaires sont difficiles à surexprimer à cause des repliements necessaires.

YOyo

[invite8135ca60]

Bonjour,
Non la protéine semble ok puisque en western je peux voir les deux formes (mature et immature) et j'arrive à enregistrer un courant très (trop!) faible mais présent quand même.
De plus la sequence de ma protéine est issue d'un plasmide qui fonctionne très bien!
Il s'agirait donc plus d'un problème venant du vecteur lui même mais je ne sais pas du tout où regarder (je suis plus physiologiste donc je suis un peu perdu dès qu'il s'agit de bio mol!)
Merci

[invitec9f0f895]

Salut

Pourquoi as tu changé de plasmide si tu en avais un qui marchait très bien? as tu séquencé l'intégralité de la séquence clonée dans le nouveau plasmide pour etre sur que tout est ok?

YOyo

[A voir en vidéo sur Futura]

[invite8135ca60]

Le changement de plasmide est dû au fait que nous n'arrivions pas à obtenir un mutant spécifique et que l'équipe d'à coté l'avait mais sur ce plasmide...
Oui séquence de la protéine est ok dans son intégralité... On essaye en ce moment de couper et lié le bout contenant la mutation... pas vraiment un bon taux de succès mais j'espère que ça marchera.
Au delà de mes manip, j'aurais quand même voulu savoir pourquoi ce plasmide nous donnes une si faible expression protéique...par curiosité...